布鲁氏菌RPA-SYBR Green Ⅰ快速检测方法的建立与应用
军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所/吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室
- 摘 要：
- 为了建立一种新型、稳定、可普遍应用的布鲁氏菌检测方法,试验将重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)方法与SYBR Green Ⅰ结合,根据布鲁氏菌bcsp31基因序列保守区设计1对特异性引物和1条标有biotin、dSpacer、C3 Spacer的特异性探针,建立一种可以检测布鲁氏菌的RPA-SYBR-Green Ⅰ方法,对该方法的反应条件和反应体系进行优化,并分析敏感性和特异性,并用该方法和ELISA方法对临床样品进行检测.结果 表明:试验成功构建出布鲁氏菌RPA-SYBR-Green Ⅰ检测方法.该方法的最佳反应条件为手掌中孵育12 min,闭合手掌即可启动RPA扩增;引物与探针的最佳比例为2.5∶1;最低检测限为1×101 cfu/mL,能够特异地检测出布鲁氏菌;对临床样品的检测结果与ELISA方法一致.说明试验建立的布鲁氏菌RPA-SYBR-Green Ⅰ检测方法特异性强,敏感性高,检测速度快,操作简单.
关键词：布鲁氏菌;SYBR-Green Ⅰ;bcsp31基因;重组酶聚合酶扩增;敏感性;特异性
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