鸡软骨细胞体外分离培养鉴定以及过表达miR-15a对软骨细胞的影响
河南农业大学;河南农业大学动物科技学院;河南省畜牧总站
- 摘 要：
- 为分析miR-15a在肉鸡不同组织中的表达情况，并探究过表达miR-15a对体外培养鸡软骨细胞的影响。本研究首先通过倒置显微镜观察、PCR、凝胶电泳和甲苯胺蓝染色对体外分离培养的软骨细胞进行鉴定。通过实时荧光定量PCR检测miR-15a在肢体内外翻畸形（valgus-varus deformity, VVD）组和健康组肉鸡中（各3只）各组织的表达量。之后通过CCK8和EDU方法分析软骨细胞过表达miR-15a后细胞增殖情况。软骨细胞转染miR-15a mimics后，通过qPCR检测软骨细胞的标志基因Collagen-2、Aggrecan、Collagen-10,成熟分化基因Runx2、Sox9、VEGF、MMP9,炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、TGF-β3以及凋亡基因Fas、FasL、Bcl-2的表达量。并构建FKBP5 3′UTR的野生型载体和突变型载体，通过双荧光素酶检测报告检测miR-15a与FKBP5的靶向关系。结果表明，本研究所用的胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶和透明质酸酶联合消化法成功分离得到状态良好的软骨细胞。荧光定量结果显示，miR-15a在各组织中均有表达，与健康组相比，miR-15a在VVD组的肝（P<0.01）、脾（P<0.05）、胸腺（P<0.01）中的表达量显著升高，在心和胸肌组织中的表达量显著降低（P<0.01）。CCK8与EDU分析结果显示，与NC组相比，过表达miR-15a组软骨细胞增殖速度显著降低（P<0.01）,增殖细胞数量显著减少（P<0.01）。qPCR结果显示，与mimics NC组相比，miR-15a mimics组的软骨细胞标志基因Aggrecan、成熟分化基因Sox9、Runx2表达量显著降低（P<0.05）,Fas基因表达量极显著上升（P<0.01）,FasL基因和抗凋亡基因Bcl-2极显著下降（P<0.01）。成功构建了FKBP5 3′UTR野生型和突变型载体，双荧光素酶检测报告结果显示预测的靶基因FKBP5与miR-15a没有靶向关系。本研究成功分离并鉴定了鸡软骨细胞，过表达miR-15a抑制鸡软骨细胞增殖、成熟和分化并促进细胞凋亡。
关键词：鸡;软骨细胞体外分离;miR-15a;组织表达谱;抑制细胞增殖;细胞凋亡;
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