贵州木霉NJAU4742几丁质酶基因chi8的克隆、表达和酶学特性研究

王小松;马磊;刘志颖;李托;朱瀚;刘东阳;沈其荣

南京农业大学江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室

摘  要：

[目的]本研究旨在从贵州木霉(Trichoderma guizhouense NJAU4742)菌株中克隆、表达几丁质酶基因chi8并深入研究其酶学特性,分析Chi8水解胶体几丁质的产物,为其在农业生产中的实际应用提供理论依据.[方法]基于序列比对获取chi8与其他几丁质酶基因的同源关系,并设计引物扩增得到完整的chi8序列,利用pET-29a质粒和大肠杆菌BL21进行异源表达;经镍柱纯化后并研究Chi8酶学特性;利用MALDI-TOF/MS检测Chi8水解胶体几丁质的最终产物;基于同源建模法构建Chi8的三维模型并与几丁六糖进行对接获取其催化相关位点信息.[结果]本试验克隆、表达得到的Chi8与哈茨木霉几丁质酶(ACM47359)的序列相似度为93.38%;Chi8在30~40℃酶活性较高且能保持较好的热稳定性,在pH6.0时酶活性为0.50 U·μmol-1·h-1;Ca2+可以显著提高Chi8的酶活性,可达到原酶活性的110.62%,而Co2+、Cu2+、Fe3+均有抑制作用,与酶作用后Chi8酶活性下降至原酶活性的89.70%、60.17%和5.93%;在酸性条件下,Chi8水解胶体几丁质的最终产物主要为几丁二糖[(GlcNAc)2].Chi8同源建模结果表明,其含有18个螺旋和15个β-折叠,末端的IMD残基可形成1个咪唑环;底物对接结果表明,Chi8中Asn197、Trp110、Tyr218、Arg274、Arg31可以与几丁六糖形成氢键,可能为该蛋白的活性中心.[结论]本试验克隆、表达得到的几丁质酶Chi8具有良好的生化特性,能够高效水解胶体几丁质并生成壳寡糖,产物主要为几丁二糖.

关键词：贵州木霉;几丁质酶;异源表达;酶学特性;壳寡糖;蛋白同源建模