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猪嵴病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

作者：

刘孟良;王潇娣;徐薇薇;周远成;陈雷

单位：

四川农业大学动物医学院;四川农业大学动物生物技术中心四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室;四川农业大学动物生物技术中心动物疫病与人类健康四川省重点实验室

关键词：

猪嵴病毒;实时荧光定量PCR;定量

摘要：

为建立一步法检测猪嵴病毒的实时荧光定量PCR检测方法,通过对猪嵴病毒3D区的PCR扩增后,连入pMD19-T载体,制备阳性标准品,进行实时荧光定量PCR。结果显示,该方法能检测出的最低拷贝数为100拷贝,扩增效率为91.8%,相关系数r2=0.992。通过对扩增曲线、熔解曲线等试验数据的分析,得出该检测方法具有良好的稳定性和较高的精确度。本研究建立的实时荧光定量PCR为一种可靠的猪嵴病毒检测方法。

译名：

Development of a real-time fluorescent quantitative PCR assay for the detection of porcine kobuvirus

作者：

LIU Meng-lianga,WANG Xiao-dia,XU Wei-weia,ZHOU Yuan-chenga, CHEN Leia,ZHU Linga,XU Zhi-wena,b (a.Animal Biotechnology Center;b.Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province, Sichuan Agricultural University,Ya'an 625014,China)

关键词：

porcine kobuvirus;SYBR GreenⅠ RT-PCR;quantitation

摘要：

The aim of this study was to develop a one-step real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) assay using a SYBR GreenⅠ dye for the detection of porcine kobuvirus in fecal samples.The assay comprised of amplifying a cDNA template generated from viral RNA and establishment of a standard curve using in vitro transcribed porcine kobuvirus RNA. The results showed that the test has a detection limit as low as 100 copies/μL RNA,a reaction efficiency of 91.8%,and a correlation coefficient(r2) of 0.992.The fluorogenic RT-PCR assay was determined to be 100-fold more sensitive than conventional RT-PCR. Furthermore,melting curve analysis showed no primer-dimers or non-specific products were produced.The one-step SYBR GreenⅠ RT-PCR developed was specific,sensitive,and reproducible for the quantification of porcine kobuvirus in fecal samples.This method may be further optimized for use as a reliable assay for diagnosing and monitoring porcine kobuvirus infections in pigs.

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