董复成;马淑丽;时娟娟;张俊梅;崔岩;任有蛇;张春香

山西农业大学动物科技学院

LCN5;附睾不同区段;精子成熟;精子贮存;公绵羊

[目的]探究绵羊附睾视黄酸结合蛋白——载脂蛋白5(lipocalin5,LCN5)在睾丸、附睾不同区段及输精管组织表达特点及其精子中的定位,为LCN5在雄性生殖器官中的功能研究提供理论依据.[方法]选择体重相近((65.23±1.95)kg)、体况良好、健康无病的9月龄公绵羊6只,其中3只使用假阴道法采集精液,3只做无菌去势.快速采集左侧睾丸(testis,T)、附睾输出小管(efferent ducts,ED)、附睾头(caput,E1-E2)、附睾体(corpus,E3-E5)、附睾尾(cauda,E6-E7)及输精管(vas deferens,VS)组织样分别置于液氮和4%多聚甲醛中.使用计算机辅助精子分析仪检测精液中精子、从右侧睾丸、附睾不同区段及输精管中分离出精子的运动学参数;利用Western blot技术和免疫组织化学法检测睾丸、附睾不同区段及输精管中LCN5蛋白表达;采用精子免疫荧光观察睾丸、附睾不同区段及输精管中精子LCN5定位及分布.[结果](1)精子运动学参数结果表明:附睾尾部和射出精子A级、C级精子数、VAP、VSL、VCL、ALH、BCF、WOB、LIN和STR均显著高于其他区段(P<0.05).输精管精子中A级精子百分比、VAP、VSL、WOB、LIN均显著高于输出小管,附睾头和附睾体段(P<0.05).然而,睾丸精子完全无运动能力.(2)Western blot结果显示LCN5在附睾头E1区段表达量最高,在附睾头E2区段、附睾尾E6区段表达量高于附睾体、睾丸和输出小管(P<0.05),定量分析结果显示LCN5蛋白表达量从高到低为:E1>E2>E6>E3≈ E5≈E4≈E7>VS>ED>T.(3)睾丸、附睾不同区段及输精管LCN5免疫组化结果表明,LCN5蛋白定位于睾丸长形精子细胞中,在ED主细胞和基底细胞中有微量表达,附睾头、附睾体和附睾尾主细胞、基底细胞及纤毛中大量表达并出现强阳性信号,管腔有颗粒状LCN5信号分散在精子聚集区内;输精管平滑肌细胞中也出现了较弱LCN5阳性信号.(4)睾丸、附睾不同区段及输精管中精子LCN5免疫荧光结果显示,LCN5在睾丸和输出小管精子顶体帽和中段中有微弱信号,在附睾头E1区段中精子顶体前端及尾部中段出现了强阳性信号.精子鞭毛上原生质滴中也有LCN5表达;精子运行到E6区段时,部分精子头部全部被包裹、原生质滴脱落完成成熟,但有些精子尾部仍有原生质滴,直到附睾尾E7区段原生质滴完全脱落.精子表面LCN5在附睾尾和体区段的表达模式与附睾头区段类似.[结论]LCN5蛋白在绵羊雄性生殖器官组织中区域性表达,高度表达在附睾头中,聚集在附睾尾E6区;LCN5蛋白在附睾头、附睾体、附睾尾及输精管的精子表面、鞭毛原生质滴中呈动态分布,这也表明其在精子成熟过程中的潜在功能.总之,LCN5可能在精子发生、成熟、贮存方面发挥重要作用,这也为后续LCN5的功能研究及其开发利用提供了理论参考.