李昂;王辉;邵玉乐;许曼;张子博;田璐;史鑫琪;孟庆文;陈洪岩

东北农业大学生命科学学院;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

TRIM30α;CRISPR/Cas9;表型分析;动物模型;

TRIM30α作为TRIM蛋白家族成员,在天然免疫系统中发挥重要作用。为了研究TRIM30α基因的特性及功能,本研究在小鼠TRIM30α基因第一段编码区选择一段作为靶序列,合成了2条sgRNA,构建了重组质粒pUC19-TRIM30α-sgRNA1/2并体外转录后分别与体外转录并加poly（A）尾的pT7-SpCas9-SV40混合后经显微注射至C57BL/6近交系小鼠的受精卵中,获得第一代（F0代）TRIM30α基因敲除的小鼠并经PCR鉴定。将其与野生型（WT）小鼠合笼繁育出TRIM30α+/-小鼠（F1代）,经PCR鉴定后再通过全同胞交配的方式获得TRIM30α基因敲除的纯合子(TRIM30α^-/-)小鼠（F2代）。通过PCR和测序在DNA水平鉴定TRIM30α^-/-小鼠各组织（心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉）TRIM30α基因的敲除情况;经RT-PCR检测TRIM30α^-/-小鼠上述各组织TRIM30α基因mRNA的转录水平;利用PCR分别扩增小鼠中的3个高频脱靶位点（Trim30d、D6WSu163e、Sbk1）后经T7E1酶切检测TRIM30α^-/-小鼠的脱靶效应。结果显示,分别获得了缺失了4 bp和7 bp片段的两种TRIM30α基因缺失的F0代小鼠（TRIM30α+/-）,选择缺失7 bp的TRIM30α+/-小鼠繁育获得F1、F2代小鼠。PCR鉴定结果显示,共获得了7只TRIM30α^-/-纯合子小鼠;从DNA水平和mRNA转录水平鉴定结果显示,TRIM30α^-/-小鼠各组织的基因组DNA扩增条带均小于WT小鼠的扩增条带;且其体内未检测到TRIM30α基因的mRNA;TRIM30α^-/-小鼠体内也未检测到其他位点的脱靶编辑;TRIM30α^-/-小鼠的生长发育、血常规、血生化指标与WT小鼠相比均无显著差异。以上结果表明TRIM30α^-/-小鼠模型构建成功。本研究为探究DNA病毒介导的天然免疫应答中TRIM30α所发挥的作用提供了实验材料和研究依据。