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猪流行性乙型脑炎病毒一步法RT-PCR的建立及达州市猪流行性乙型脑炎病毒流行病学调查与分析

作者：

何博;王勤;欧云文;刘俐君

单位：

达州职业技术学院;开江县动物疫病预防控制中心;中国动物卫生与流行病学中心

关键词：

猪流行性乙型脑炎病毒;一步法RT-PCR;检测方法;流行病学调查与分析;

摘要：

为了建立一种快速检测猪流行性乙型脑炎病毒（Janpanese encephalitis virus, JEV）的病原学检测方法,并掌握达州市JEV的感染情况,试验根据GenBank中JEV E基因序列设计1对检测引物,建立一步法RT-PCR,并对退火温度（50,52,54,56,58℃）、模板添加量（1,2,4,6,8μL）、引物添加量（0.1,0.2,0.4,0.6,0.8μL）进行优化,考察方法的特异性、敏感性、重复性、符合性,同时对2017—2020年分别采集于达州市7个市（县、区）的243份样品进行JEV检测,对检测结果进行不同地区、不同年份、不同季节、不同饲养方式下猪群中JEV阳性率的比较分析。结果表明:优化后的一步法RT-PCR扩增体系为2×Step Buffer 12.5μL,上下游引物（20μmol/L）各0.4μL,RNA（68 ng/μL）4μL,H₂O 7.7μL。扩增程序为50℃30 min; 95℃5 min; 94℃40 s, 54℃40 s, 72℃40 s, 30个循环;72℃10 min; 4℃终止反应。该方法能够特异性扩增JEV,而检测猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪细小病毒（PPV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）均为阴性,对JEV RNA的检测灵敏度为27.2 pg,对JEV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV、PRV、PCV-2、PPV、3份JEV阳性病料、3份JEV阴性病料重复检测3次的结果完全一致,检测243份猪临床病料样品的平均阳性率为9.05%,其中不同地区阳性率为3.45%～13.04%,2017,2018,2019,2020年阳性率分别为5.77%、6.90%、10.29%和12.31%,夏季和冬季的阳性率分别为13.33%和5.17%,规模化养猪场和散养户的阳性率分别为5.94%和11.27%,说明建立的JEV一步法RT-PCR具有良好的特异性、敏感性、重复性和临床适用性,达州市JEV的流行存在个别地区感染情况较严重、2019年和2020年感染情况较2017年和2018年严重、夏季感染情况较冬季严重、散养户感染情况较规模化养猪场严重等特点。

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