杨帆;胡章薇;严浩浩;刘耀霞;张学飞;闫佳会;侯璐;姚强

青海大学农林科学院青海省农业有害生物综合治理重点实验室/农业农村部西宁作物有害生物科学观测实验站

大麦坚黑粉菌;裸黑粉菌;青稞黑穗病;环介导等温扩增技术;

【目的】大麦坚黑粉菌（Ustilago hordei）和裸黑粉菌（Ustilago nuda）是引起青藏高原青稞黑穗病的主要病原菌,建立快速、简便、特异性强的大麦坚黑粉菌和裸黑粉菌环介导等温扩增技术（LAMP）检测体系,检测青稞种子的带菌量,再依据带菌程度进行播前种子处理,是控制青稞黑穗病的重要技术手段。【方法】根据大麦坚黑粉菌（Ustilago hordei）和裸黑粉菌（Ustilago nuda）的ITS基因序列与其他对照菌株同源性低的区段设计并获得有效引物1组,建立LAMP检测体系,并选取影响LAMP反应体系的5个主要因素dNTPs、甜菜碱、镁离子、Bst DNA聚合酶及温度进行单因素试验对其进行优化,最后对优化后的LAMP检测体系进行灵敏度和特异性检测。【结果】建立了青稞黑穗病菌的LAMP检测体系,其优化后dNTPs浓度为1.8 mmol/L、甜菜碱浓度为0.8 mmol/L、镁离子浓度为10 mmol/L、Bst DNA聚合酶浓度为320 U/mL,反应温度为65℃。应用该体系在45 min内能检测出2×10^-4ng/μL的裸黑粉菌,在60 min内能检测出2×10^-4 ng/μL的大麦坚黑粉菌,即在60 min内可检测出2×10^-4ng/μL的大麦坚黑粉菌和裸黑粉菌。建立的青稞黑穗病菌LAMP检测体系对大麦坚黑粉菌和祼黑粉菌具有特异性。【结论】建立了青稞黑穗病菌的LAMP检测体系,该体系能在1 h内检测出2×10^-4ng/μL的裸黑粉菌和大麦坚黑粉菌。