史慧君;董文丽;郭妍婷;袁圆圆;陈俊贞;杨莉;冉多良;付强

新疆农业大学动物医学学院

信号肽酶复合体亚基1;牛病毒性腹泻病毒;5′非翻译区;双链RNA;复制;

旨在探明信号肽酶复合体亚基1（signal peptidase complex subunit 1,SPCS1）影响牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus, BVDV）复制的作用。使用Benchling和CHOPCHOP等平台设计靶向SPCS1基因的sgRNA,克隆至慢病毒载体lentiCRISPR v2,连同包装质粒pSPAX2和pMD2.G转染至人胚肾细胞HEK-293T中，包装慢病毒并感染MDBK细胞，用嘌呤霉素筛选5代后获得敲低SPCS1蛋白后稳定表达的细胞，用Western blot检测SPCS1蛋白表达的情况；使用荧光定量PCR和免疫荧光分析检测BVDV感染SPCS1蛋白敲低细胞不同时间后5′非翻译区（untranslated region, UTR）mRNA的水平和双链RNA（double-stranded, dsRNA）积累，利用倒置显微镜观察BVDV致细胞病变（cytopathic effect, CPE）情况，根据Reed-Muench方法测定病毒滴度变化情况。结果：Western blot检测SPCS1蛋白表达量明显下降，成功构建SPCS1敲低（knockdown, KD）细胞；BVDV感染SPCS1 KD细胞后与对照Scramble相比，BVDV 5′UTR mRNA水平和dsRNA量均显著性降低（P<0.01）,CPE现象推迟并减弱，子代病毒滴度显著性下降（P<0.01）,最高降低95.8%。SPCS1敲低后显著性影响BVDV复制，为BVDV防控新技术的建立提供理论依据。