李泽宇;王俊;刘芯怡;刘心愿;杨莉;史慧君;常继涛;尹鑫;付强

中国农业科学研究院哈尔滨兽医研究所;新疆农业大学动物医学学院

天然小分子药物;小檗胺;牛冠状病毒;病毒复制;病毒滴度

为研究小檗胺（BBM）是否具有抑制牛冠状病毒（BCoV）复制的作用，本研究采用不同浓度BBM（0、1μmol/L、5μmol/L、8μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L）处理人回盲肠癌细胞（HRT-18G），于处理后不同时间（0、12 h、24 h、36 h、48 h）采用CCK-8法分析BBM对HRT-18G细胞存活率的影响，以确定BBM对HRT-18G细胞的毒性作用。BBM预处理HRT-18G细胞后，将100 TCID₅₀牛冠状病毒（BCoV）感染细胞，24 h和48 h后收集细胞，采用荧光定量PCR（qPCR）检测BCoV N基因mRNA的转录水平，同时采用western blot检测BCoV N蛋白表达水平、经倒置显微镜观察细胞病变（CPE）情况、Reed-Meuench法检测病毒滴度等方法检测BBM预处理对BCoV N基因mRNA的转录水平、BCoV N蛋白表达水平、致CPE作用、子代病毒滴度等的影响。结果显示，低浓度BBM短时间处理对HRT-18G细胞存活率的抑制作用较低，当处理时间达到24 h时15μmol/L、20μmol/L、40μmol/L和60μmol/L BBM均极显著降低细胞存活率（P<0.01）；因此采用5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L和60μmol/L浓度的BBM作用HRT-18 G细胞进行后续研究。qPCR结果显示，与NC组相比20μmol/L BBM预处理HRT-18G细胞24 h即可极显著降低BCoV N基因mRNA的转录水平（P<0.01）;western blot结果显示，与NC组相比，40μmol/L BBM预处理HRT-18G细胞48 h可完全抑制BCoV N蛋白的表达；CPE观察结果显示，与NC组相比，40μmol/L和60μmol/L BBM预处理24 h和48 h可减轻BCoV感染引起的CPE；子代病毒滴度检测结果显示，与NC组相比，40μmol/L和60μmol/L BBM可极显著降低BCoV子代病毒滴度（P<0.01）。综上所述，本研究首次证实BBM具有抑制BCoV复制的作用，为防控BCoV的感染提供了新方法，同时为开发BBM作为抗病毒药物提供参考依据。