唐波;杜娟;杨力侠;王小海;吴海波;吴勇延;郭泽坤

西北农林科技大学生命科学学院

Sumo;蛋白质体外修饰;原核表达;Oct4;Sox2

【目的】构建一种可获得Sumo修饰蛋白的原核表达系统,为Sumo化修饰蛋白的批量制备奠定基础。【方法】用Trizol裂解法提取小鼠畸胎瘤细胞F9的总RNA,反转录成cDNA后PCR扩增获得Sumo1、Ubc9、Sae2和Sae1基因。将上述基因及相应载体酶切、连接后构建出重组质粒pACYC-Ubc9-Sumo1、pCDF-Sae2-Sae1。采用质粒转化-制备阳性克隆感受态细胞-质粒转化的方法获得pACYC-Ubc9-Sumo1和pCDF-Sae2-Sae1共表达的Su-mo化修饰的原核表达系统。以pGEX-GST-Sox2和pGEX-GST-Sox2K247R重组质粒为例,采用Western Blot检测蛋白质Sumo化修饰原核表达系统的有效性。用另一Sumo修饰底物Oct4及其Sumo修饰位点突变的突变体Oct4K118R转化原核Sumo修饰系统,并连续传代,检测蛋白质Sumo化修饰系统的实用性及遗传稳定性。【结果】构建的蛋白质Sumo化修饰原核表达系统可特异修饰Sumo1的底物Sox2和Oct4;含有Oct4原核表达载体的蛋白质Sumo化修饰系统可稳定传至15代,系统的稳定性较好。【结论】获得了成本较低、特异性强、重复性好、稳定性强的可用于制备Sumo化蛋白的原核表达系统。