费伟强;陈琴;陈倩;梅文枫;边腾飞;吕正兵;于威;陈健;张耀洲;吴祥甫

浙江理工大学生物化学研究所;浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室;浙江中烟工业有限责任公司

家蚕杆状病毒穿梭载体;Red重组;复制缺陷型;转染;正筛选

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)表达载体系统可以利用线性化技术或通过Bac-to-Bac系统构建重组病毒。为了解决采用这些方法构建重组病毒需要多步克隆和筛选,无法满足实验室水平快速和高通量表达目的蛋白质需求的问题,建立了一种快速便捷的重组病毒构建方法。首先以BmNPV基因组为基础构建家蚕杆状病毒穿梭载体BmBacmid,进而利用Red重组技术敲除病毒复制必需基因orf1629的部分序列,构建了一种复制缺陷型BmNPV穿梭载体RD-BmBacmid。利用RD-BmBac-mid单独转染或者与pBacPAK8-AcGFP共转染BmN细胞,证实了该载体的复制缺陷性,即需经同源重组修复orf1629基因后方可产生重组病毒。利用复制缺陷型BmNPV载体正筛选可以快速构建重组病毒表达目的蛋白质。