王琳;袁建林;缪昌;马玉晗;曹三杰;赵勤

四川农业大学动物医学院猪病研究中心

POR;CRISPR/Cas9;LO2细胞;AFB₁

为了构建POR基因稳定敲除(POR^KO)、回补(POR^CO)、过表达(POR^OE)的LO2细胞株，以便为后续深入开展POR基因在AFB₁致毒性机理中的功能研究提供细胞模型。本研究首先利用CRISPR/Cas9技术设计2条靶向POR基因的sgRNA并克隆至lentiCRISPR v2载体，进行慢病毒包装与感染，筛选出LO2 POR^KO单克隆细胞后进行测序及Western blot鉴定。其次用同源重组方法构建pcDNA3.1（+）/myc-His B-POR重组质粒，经对POR^KO细胞和野生型细胞转染分别构建LO2 POR^CO及LO2 POR^OE细胞株，以G-418筛选后进行Western blotting鉴定。再用4μmol·L^-1及8μmol·L^-1 AFB₁分别对野生型、LO2 POR^KO、LO2 POR^CO、LO2 POR^OE细胞株染毒48 h,观察细胞形态并测定细胞存活率。结果表明，靶向exon5的sgRNA-2可成功敲除POR基因，得到LO2 POR^KO细胞株；成功构建表达POR重组蛋白的LO2 POR^CO及LO2 POR^OE细胞株。对AFB₁处理后的各细胞存活率测定结果表明，相较于野生型LO2细胞43.66%±0.58%和27.90%±0.46%的存活率，LO2 POR^KO细胞存活率具有极显著性差异，均为100%（P＜0.000 1）;LO2 POR^CO细胞存活率仍有显著性差异，分别为57.07%±0.74%和42.54%±0.68%（P＜0.05）;LO2 POR^OE细胞存活率则显著降低，分别为24.58%±0.92%和17.99%±0.81%（P＜0.01）。综上所述，本研究成功构建了LO2 POR^KO、LO2 POR^CO、LO2 POR^OE细胞株，并以AFB₁染毒处理分别研究了各细胞株的存活率和细胞形态学变化，发现POR基因对AFB₁所致细胞毒性的影响巨大。研究结果为后续深入开展POR基因在AFB₁致毒性机理中的功能研究奠定了基础。