RNA提取和cDNA制备　　取冻存于–80℃抹香鲸和长江江豚组织, 利用TRIzol (Invitrogen, Karlsruhe, Germany)进行RNA的提取, 使用QIAamp RNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)试剂盒提取白鲸血液RNA, 提取的RNA溶解于RNA-free的水中, 保存于–80℃。利用Thermo公司的反转录试剂盒合成抹香鲸, 长江江豚和白鲸的cDNA, 保存于–80℃备用。

基因克隆　　参照NCBI上的虎鲸(Orcinus orca)、瓶鼻海豚(Bottlenose ballphins)、白暨豚(Lipotes vexillifer)及牛的核酸序列保守区, 利用Primer Premier version 5.00 (Premier Biosoft International, Palo Alto, California)设计引物(虎鲸XM_004281591; 瓶鼻海豚XM_004310255; 牛NM_001206046; 白暨豚XM_007466989.1)。由于PHD2序列的前端GC含量太高, 难以一次扩增全长序列, 分析序列后按照表 1的引物分两段扩增长江江豚的PHD2基因, 利用I-5^TM 2×High Fidelity Master Mix高保真酶(擎科生物)反应体系: 1.0 µL cDNA模板(100 ng/µL)、1.5 µL上游引物(10 µmol/L)、1.5 µL下游引物(10 µmol/L)、20 µL PCR MasterMix (含染料)和16 µL ddH₂O; 扩增程序设定为: 98℃ 5min预变性; 98℃ 15s, 58℃ 30s, 72℃ 25s, 35个循环; 72℃延伸7min。

质粒构建　　将得到的长江江豚的PHD2的全基因序列, 插入到pCMV-HA中, 构建带有标签的可表达质粒pCMV-Ha-FP-PHD2。由于抹香鲸和白鲸样品PHD2序列扩增出部分序列, 根据NCBI上的PHD2氨基酸序列(抹香鲸XM_007127611.2; 白鲸XM_022553237.1), 进行合成, 在擎科生物(北京)合成抹香鲸的PHD2质粒, 即pCMV-MYC-SW-PHD2。在奥科生物(北京)合成白鲸的PHD2质粒, 即pCMV-MYC-BW-PHD2。

将抹香鲸、白鲸和长江江豚的HIF-1α和HIF-2α的ODDD区的LXXLAP片段中的脯氨酸Pro突变为丙氨酸Ala^{[24, 25]}, 构建相关的突变体质粒。将抹香鲸、白鲸和长江江豚的PHD2的酶催化区域的组氨酸His(密码子为)突变为丙氨酸Ala^{[26, 27]}, 构建相关的突变体质粒。

细胞培养　　由于缺少标准化的鲸类细胞系, 故而使用人类肾源上皮细胞(HEK293T)细胞进行实验。HEK293T细胞使用终浓度为10%的胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS, Hyclone), 高糖DMEM 培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, Gibco)于37℃、5% CO₂的培养箱中进行培养。

细胞转染　　接种HEK293T细胞于培养皿中, 参照VigoFect(Vigorous Biotech, Beijing, China)说明书, 在1.5 mL EP管中使用80 μL DMEM培养基稀释0.4—1.2 μL VigoFect, 充分混匀, 室温静置5min; 在另一个EP管中使用80 μL未加血清DMEM培养基稀释1—3 μg质粒DNA(质粒﹕VigoFect =1﹕0.4)。室温静置5min后, 将两种溶液混合均匀, 制备DNA-脂质体复合物, 室温孵育15min后, 将其均匀滴加至培养的细胞中。

荧光素酶活性分析　　将HEK293T细胞按照合适比例分至24孔板中, 待细胞密度长至80%—90%, 每孔转染100 ng的Promoter-HRE(Hypoxia response element)、10 ng的内参pTK-renilla和200 ng的目的质粒, 包括空白对照的空载体、3种鲸的PHD2质粒、HIF-1α/HIF-2α及PHD2质粒与HIF-1α/HIF-2α共转染, 每组设置3个重复孔。24h后, 吸去培养基, 每孔加入1×passive lysis buffer, 放置于摇床, 裂解30min后, 使用荧光检测仪分别测取加入荧光底物LARII和Stop(Promega)荧光值, 记录, 分析。

蛋白质免疫印迹实验　　将HEK293T细胞按照合适比例分至2个相同的6孔板中, 待细胞密度长至80%—90%, 每孔转染500 ng各个物种PHD2或者MYC-empty/HA-empty, 2000 ng对应物种的HIF-1α/HIF-2α, 转染6h后, 将一盘6孔板置于低氧工作站(37℃ 2%O₂), 18h后, 取出细胞培养箱和低氧工作站的6孔板, 吸除培养基, 加入细胞裂解液, 4℃裂解30min后, 收细胞, 4℃ 12000×g离心15min后, 吸取50 μL的蛋白样品, 加入等体积的2×上样缓冲液(2×loading buffer)和5%体积的β-巯基乙醇(武汉天源生物), 将样品放入沸水中加热6min得到制备好的蛋白样品。将蛋白样品和蛋白marker(Thermo), 200 V恒压下进行SDS-PAGE电泳, 待蛋白marker电泳分出清晰的条带后, 150 mA恒流转膜3h, 将PAGE凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上。根据目的基因所带标签使用对应的抗体孵育, 在孵育结束之后, 使用荧光成像系统(Fuji Film LAS4000 mini luminescent)进行显色和拍照。

所用抗体: anti-Myc (9E10, 1﹕1000 for IB analysis, Santa Cruz), anti-HA antibody (1﹕5000 for IB analysis, Covance), anti-GAPDH antibody (SC-47724, 1﹕1000, Santa Cruz)

数据分析　　对于荧光素酶活性分析, 每组设计3个重复组, 记录每孔添加LARII和Stop之后的值, 计算二者比值, 利用GraphPad Prism 5(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)软件进行数据分析。