袁世豪;张海琳;鞠宁;王新乐;赵海渊;邵怡岚;李佳璇;姜艳平;崔文;唐丽杰;李一经;王晓娜

东北农业大学动物医学学院

乳酸菌表达系统;组成型启动子;报告基因系统;外源蛋白表达

【目的】构建不同组成型启动子的乳酸菌表达载体系统，评价不同启动子驱动外源基因表达的活性，筛选出强表达的启动子，为后续研究乳酸菌作为活菌载体表达外源抗原或功能性蛋白提供理论依据。【方法】以大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体pPG为骨架，将表达载体中启动子序列分别替换为组成型强启动子Pldh、PHH和Phce,利用PCR方法扩增报告基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和氨苄青霉素抗性基因（Ampr）,并在下游多克隆位点中分别插入荧光素酶（LUC）、EGFP和Ampr报告基因，构建9种乳酸菌表达质粒，电转入副干酪乳杆菌HLJ-27感受态细胞，筛选获得9株重组乳酸菌。通过实时荧光定量PCR检测报告基因在重组菌中的mRNA转录水平，利用Western blotting和间接ELISA检测蛋白的表达量，并检测表达蛋白的活性，以评估3个启动子的活性强弱。【结果】PCR成功扩增出大小约720 bp的EGFP基因和850 bp的Ampr基因。Western blotting结果显示，在9株重组乳酸菌中，分别成功表达出了58 ku的LUC蛋白、26 ku的EGFP蛋白和28 ku的Ampr蛋白。实时荧光定量PCR和间接ELISA检测结果显示，启动子Pldh启动外源基因转录水平和驱动外源蛋白表达水平均显著高于启动子PHH和Phce（P＜0.05;P＜0.01）。报告基因检测结果显示，启动子Pldh驱动LUC、EGFP和Ampr外源蛋白的活性显著高于启动子PHH和Phce（P＜0.05;P＜0.01）。【结论】本研究成功构建了3种启动子报告基因表达系统，确定了3种启动子活性强弱依次为Pldh、PHH和Phce,探究出一种启动子活性筛选的优势筛选系统——Ampr报告系统，为高表达乳酸菌载体系统的建立提供了必要的依据。