外泌体可携带多种核酸、蛋白质、脂质以及小分子物质等重要信息物质，形成细胞间通信，直接影响细胞迁移、免疫反应和细胞分化生长等过程。外泌体具有脂质双层膜结构，其组成成分和功能具有特异性，被其包裹的内容物可稳定存在^[16]。外泌体的形成以及被包裹内容物的分拣、释放是一系列精细调控的过程，需要很多蛋白质和能量的参与。细胞通过不断吸收释放外泌体，实现了与外界微环境的信息交互，参与到各种生理病理疾病中。本研究提取的大白猪spEX平均粒径约为96.9 nm，电镜下形态呈茶杯托状结构，Western blot结果显示大白公猪精浆外泌体中Tsg101和Hsp70 蛋白表达为阳性，这与其他报道EX的特征结果一致^[17]，表明已成功提取到大白猪精液中的spEX。

精液中的EX主要是睾丸、附睾、副性腺分泌物的混合物，即精浆外泌体。其成分因动物物种而异^[18]。在外泌体运载的生物分子中，越来越多miRNA的作用被发掘关注。有研究表明miRNA是外泌体中含量最丰富的细胞间信息交流的主要分子之一^[19]，外泌体携带的生物活性调节分子参与精子发生、修饰加工及受精能力的调控^[20]。一些miRNA的数量和种类一旦改变会导致配子发育停滞、精卵受精障碍和各种生殖系统疾病的产生，显示出EX携带的miRNA在配子发育和精子加工中起重要作用^[20-21]。本研究主要对大白公猪spEX miRNA的表达情况进行检测，并对前10个高丰度的miRNA相关功能进行预测，分析发现高表达的前10个miRNA中let-7家族占了4个(let-7c、let-7a、let-7f-5p、let-7e)，显著高于其他miRNA。其中，let-7家族在哺乳动物、昆虫和植物中高度表达和保守，是基本生物学过程中最重要的miRNA调节因子之一^[22]。有研究表明在公猪睾丸中miR-let-7家族的成员(let-7a-5p、let-7f-5p、let-7c-5p)高度表达，这与本研究预测结果基本一致，let-7家族可能与公猪睾丸的发育和睾丸中精子发生有关^[23]，在生精过程中，高水平的let-7表达可能会改变正常生精所需的蛋白质的产生，从而影响与精子形态和运动性相关的蛋白质^[24]。miR-let-7a在猪睾丸^[23]、小鼠附睾精液^[25]、人精浆^[26]中均有发现，提示其可抑制维甲酸诱导的精原细胞分离并介导胚胎附着^[27]。精子获能的过程需要能量，miR-26a与精子能量代谢有关，其可能影响精子活力和凋亡^[28]，有研究表明PDHX基因可能是miR-26a的潜在靶点，其参与丙酮酸氧化脱酸连接糖酵解和氧化磷酸化的关键步骤，可以调节糖代谢途径，最终影响公猪精子的活力和存活率^[29]。范宇^[30]研究表明，miR-26a可以调节PTEN表达，通过靶向调控PTEN减少精子细胞凋亡和促存活作用，这可能是雄性不育的原因。在公猪中，miR-26a被多个环状RNA靶向以调节精子活力，这也表明miR-26a 具有作为精子质量和雄性生育能力的非侵入性生物标志物的潜力^[31]。精子的发生包括3个主要发育阶段：精原干细胞自我更新、精原干细胞分化和精子细胞变形，在每个阶段中均检测到miRNA表达，许多miRNA参与调节睾丸的发育阶段和控制精子发生^[32-33]。有研究报道血浆外泌体中高表达的miRNA没有发现miR-10家族^[34]，这排除了miR-10家族来自血浆的可能性。有研究分析miR-10b在不同年龄的小鼠睾丸中表达，且在睾丸发育过程中表达降低^[35]，Li等^[36]研究发现miR-10b主要在thy1细胞中表达，并且在出生后第6天的小鼠睾丸中高表达，这些结果表明miR-10b在精原干细胞有丝分裂的调节中起作用，可能与精子发生有关。本研究结果显示spEX也检测到miR-10家族，说明了miR-10家族可能是在附睾或副性腺等生殖器官中特异性表达。

GO和KEGG通路分析表明，高表达miRNA的靶基因在P53信号通路、精子受精、负调控凋亡过程、跨膜运输和能量代谢等方面具有潜在的调控作用。P53是细胞内最重要的蛋白之一，能介导细胞应答诸多类型的应激信号。P53蛋白通过参与促进DNA损伤修复、诱导细胞周期阻断、细胞衰老凋亡等通路来维持基因组的稳定性和完整性^[37]。有研究表明，P53信号通路与男性生殖能力有关^[23]，这也说明了精浆外泌体中的miRNA可能与公猪繁育有关。有些前列腺小体(前列腺分泌的外泌体)可以特异性地将遗传物质和生物活性物质传递给精子，随后可以提高精液质量和公猪的受精率^[38]。有研究发现，前列腺癌患者血清中miR-141的含量明显增高，且与特异性抗原(PSA)相比较，两者具有相关性，表明miRNA在前列腺癌的发生中起着非常重要的作用^[39]。因此这些表达失调的miRNA可能可以用于癌症的诊断、治疗以及治疗效果的评价。此外，通路分析表明，高表达miRNA的靶基因参与了氧化磷酸化和泛素介导的蛋白水解等活动。蛋白质磷酸化对精子活力至关重要，研究显示，核糖体蛋白S6激酶A3(RPS6KA3)与磷酸化(V-ATPase)运输调节有关，RPS6KA3磷酸化各种底物，这种蛋白质的活性与控制细胞生长和分化有关^[40]。泛素蛋白酶体系统可通过降解有毒蛋白质聚集体和错误折叠的蛋白质来参与调节精子蛋白质的稳态^[41]。在附睾运输过程中，附睾起始段的精子蛋白与附睾尾段的精子蛋白不一致，意味着运输过程中精子蛋白选择性丢失^[42]。泛素介导的蛋白水解过程可能在精子附睾成熟阶段发挥作用。

综上，本研究报道大白公猪精浆外泌体高表达的前10个miRNA，通过靶基因预测和通路富集分析，预测了这些miRNA可能与精子的发生、P53信号通路、线粒体外膜调节、精细胞发育等过程有关，为大白公猪精浆外泌体中miRNA基因表达调控研究提供基础数据，这将有助于确定与精子的生育能力有关的基因及利用miRNA作为生物标志物预测公猪的生育力。但本研究结果基于生物信息学预测，所涉miRNA、靶基因及其相关通路还需进一步试验验证。