中国畜禽种业 2019(9),92-94

两种检测猪瘟和猪伪狂犬病毒抗体方法比较

谢玉洁;占松鹤;何长生;章健;张贺森;李郁

安徽农业大学动物科技学院 ;安徽省阜阳市动物卫生监督所 ;安徽省动物疫病预防与控制中心 ;成都微瑞生物科技有限公司 ;安徽农业大学动物科技学院

摘  要：

为评价Wellray CSFV和PRV抗体快速检测方法在临床样品检测中的适用性, 将其与IDEXX公司ELISA抗体检测方法进行比较试验.试验对177份血清进行CSFV抗体、 PRV gB和PRV gE抗体的对比检测.结果显示, Wellray CSFV抗体快速检测方法与IDEXX公司ELISA抗体检测方法的符合率、相对敏感性、相对特异性分别为87.72[%]]、 96[%]]、 81.25[%]], Kappa值=0.756, PRVgB 抗体分别为 92.06[%]]、 91.67[%]]、 92.59[%]], Kappa值=0.839, PRVgE 抗体分别为 84.21[%]]、 85.71[%]] 、83.33[%]], Kappa值=0.671.结果表明, Wellray CSFV和PRV抗体快速检测方法与IDEXX公司ELISA抗体检测方法的符合率、相对敏感性、相对特异性都较高, 且不需要昂贵复杂的仪器设备, 15min内即可完成检测, 能更好地适应基层检测的实际需求.

关键词：猪瘟病毒抗体;猪伪狂犬病病毒;gB和gE抗体;检测方法;符合率;比较

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猪瘟 (Classical swine fever, CSF﹚ 是由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒 (Classical swine fever virus, CSFV﹚ 引起的一种急性、 热性、 高度接触性传染病, 以发病急、 高热稽留和细小血管壁变性引起广泛出血、 梗塞和坏死等变化为特征[1]。 猪伪狂犬病 (Pseudorabies, PR﹚ 是由猪伪狂犬病病毒 (Pseudora-bies virus, PRV﹚ 引起的多种家畜和野生动物共患的一种急性、热性传染病, 主要以仔猪致命性脑炎、 育肥猪呼吸道症状及母猪流产为特征 [2]。 CSF 和 PR 是目前危害中国养猪业发展的主要疫病之一。 世界动物卫生组织 (OIE﹚ 将 CSF 和 PR 列为必须通报的动物疫病, 我国农业农村部则将 CSF 和 PR 分别列为一类和二类动物疫病, 同时 CSF 和 PR 也是我国 《国家中长期动物疫病防治规划 (2012-2020 年﹚》 中优先防治的动物疫病,并要求至 2020 年全国所有种猪场达到净化标准。

疫苗接种是预防和控制 CSF 和 PR 的重要手段, 而检测血清抗体不仅可为 CSF 和 PR 免疫提供依据, 也可进行 PRV 野毒感染的鉴别。 OIE 推荐的 CSFV 和 PRV 抗体检测方法是酶联免疫吸附试验 (ELISA﹚ 和抗体中和试验 (ANT﹚, 但 ANT 对实验条件和操作人员的要求很高, 且耗时长, 仅适合专业实验室进行少量样本检测, 不宜推广应用。 由于 ELISA 具有快速、 灵敏、 简便、 载体易于标准化等优点, 因此, 该方法是当前国际上承认的唯一适合大规模应用的 CSFV 和 PRV 抗体检测方法。

目前商品化的 CSFV 和 PRV 抗体 ELISA 检测试剂盒有阻断ELISA 和间接 ELISA 两种。 在评价 ELISA 检测方法时, 最重要的两个指标是敏感性和特异性。 阻断 ELISA 使用了单克隆抗体, 因此, 检测的特异性更高; 而间接 ELISA 更侧重于敏感性。 两种 ELISA 法在实际应用过程中均具有合理性, 但需要比较完备实验仪器 (如全波长酶标仪等﹚ 和经验丰富的技术人员, 且一次检测至少需要 4h, 对于基层兽医机构、 养猪场来说适用性不强。 Wellray CSFV 和 PRV 抗体快速检测方法系应用镧系元素作荧光标记物建立的一种既具有金标层析技术简单、 方

便、 快捷, 又具有 ELISA 准确、 特异、 敏感的CSFV 和 PRV 抗体镧系荧光免疫层析法 (LFICA﹚[3]。为进一步评价 LFICA 在检测临床样品中的适用性, 本试验将 Wellray CSFV 和 PRV 抗体快速检测方法与美国爱德士 (IDEXX﹚ 公司生产的 ELISA 抗体检测方法进行比较, 以期为临床检测提供性价比高、 使用方便、特异性强、 灵敏度高的检测方法。

1 材料与方法

1.1 检测试剂盒

Wellray CSFV抗体快速检测试剂盒 (以下简称CSFV-Ab- LFICA﹚, Wellray PRV-gB、 PRV-gE抗体快速检测试剂盒 (以下分别简称PRV-gB-Ab-LFICA、 PRV-gE-Ab-LFICA﹚ 均为成都微瑞生物科技有限公司产品。 美国爱德士 (IDEXX﹚ 公司生产的ELISA (阻断法﹚ CSFV抗体检测试剂盒 (以下简称CS- FV-Ab-ELISA﹚, ELISA (间接法﹚ PRV-gB、 PRV-gE抗体检测试剂盒 (以下分别简称PRV-gB-Ab-ELISA、 PRV-gE-Ab- ELISA﹚。

1.2 检测样品

被检血清共计177份, 其中用于检测CSFV-Ab的血清57份, 检测PRV-gB-Ab的血清63份, 检测PRV-gE-Ab的血清57份。

1.3 检测方法

1.3.1 Wellray CSFV-Ab-LFICA、 PRV-gB-Ab-LFICA 和 PRV-gE-Ab-LFICA

按照试剂盒使用说明进行。 依据检测需求信息选择相应批次的标准曲线、 高敏荧光分析仪检测的检测线 (T﹚ 和质控线(C﹚ 的荧光信号, 进行T/C荧光比值云平台自动计算。 结果判定: T/C值>0.1为阳性, T/C值<0.1为阴性。

1.3.2 IDEXX CSFV-Ab-ELISA

按照试剂盒使用说明进行。 当阴性平均值＞0.500, 阳性对照阻断率＞50%时, 检测结果有效。 阻断率/%=100× [阴性对照

A (450﹚ 值-样本 A (450﹚ 值] /阴性对照 A (450﹚ 值。 结果判定: 样品的阻断率≥40%为阳性, 30%＜阻断率＜40%为可疑阻断率≤30%为阴性。

1.3.3 IDEXX PRV-gB-Ab-ELISA 和 IDEXX PRV-gE-Ab-ELISA

分别按照试剂盒使用说明进行。 当阴性平均值减去阳性平均值≥0.300 时检测结果有效。 S/N=样品 A (650﹚ 值/阴性平均值。 结果判定: 样品的 S/N≤0.6 为阳性, 0.6＜S/N≤0.7 为可疑,S/N＞0.7 为阴性。

1.3.4 符合率比较

用 Wellray 和 IDEXX 的两种检测方法对 177 份血清进行检测, 检测试剂盒均在有效期内, 操作和结果判定均按试剂盒说明书进行。 参考吴泰相等[4]的方法 (表 1﹚, 计算符合率、 相对敏感性和相对特异性。 符合率= (a+d) /(a+b+c+d); 相对敏感性=a/(a+c); 相对特异性=d/(b+d); Kappa 值计算公式: Kappa=2(ad-bc) /(p1q2+p2q1)。 Kappa 值＞0.8, 表明一致性极高; 0.60＜Kappa 值≤0.80; 表明高度一致; 0.40＜Kappa 值≤0.60; 表明中度一致; Kappa 值≤0.40, 表明一致性差。

2 结果与分析

2.1 CSFV-Ab 检测

采用 Wellray CSFV-Ab-LFICA 和 IDEXX CSFV-Ab-ELISA两种检测方法对 57 份血清进行 CSFV-Ab 检测。 结果显示,Wellray CSFV-Ab-LFICA 检出阳性 30 份、 阴性 27 份; IDEXXCSFV-Ab-ELISA 检出阳性 25 份、 阴性 32 份; 符合率 87.72%,相对敏感性 96%, 相对特异性 81.25%, Kappa 值为 0.756, 表明两者高度一致, 见表 2。

2.2 PRV-g B-Ab 检测

采用 Wellray PRV-gB-Ab-LFICA 和 IDEXX PRV-gB-Ab-ELISA 两种检测方法对 63 份血清进行 PRV-gB-Ab 检测。 结果显示, Wellray PRV-gB-Ab-LFICA 检出阳性 35 份、 阴性 28份; IDEXX PRV-gB-Ab-ELISA 检出阳性 36 份、 阴性 27 份;

符合率 92.06%, 相对敏感性 91.67%, 相对特异性 92.59%,Kappa 值为 0.839, 表明两者一致性极高, 见表 3。

2.3 PRV-g E-Ab 检测

采用WellrayPRV-gE-Ab-LFICA和IDEXX PRV-gE-Ab- ELISA两种检测方法对57份血清进行PRV-gE-Ab检测。 结果显示, WellrayPRV-gE-Ab-LFICA检出阳性24份、 阴性33份; IDEXX PRV-gE-Ab-ELISA检出阳性21份、 阴性36份; 符合率84.21%, 相对敏感性85.71%, 相对特异性83.33%, Kappa值为0.671, 表明两者高度一致, 见表4。

3 讨论与结论

通常反映试验判定结果与标准诊断结果一致性的 2 个指标是符合率和 Kappa 值, 而反映试验结果的真实性是特异性和敏感性 [5-6]。 本试验系采用了两种检测 CSFV 和 PRV 抗体检测方法进行比较, 结果显示, Wellray CSFV 抗体和 PRV (gB、 gE﹚抗体 LFICA 快速检测方法与国际通用的美国爱德士 (IDEXX﹚公司生产的 ELISA 抗体检测方法的符合率分别为 87.72%、92.06% 、 84.21% , 相 对 特 异 性 分 别 为 81.25% 、 92.59% 、83.33%, 相对敏感性分别为 96%、 91.67%、 85.71%; Kappa 值分别为 0.756、 0.839、 0.671。 结果表明, Wellray CSFV 和 PRV抗体 LFICA 快速检测方法与美国爱德士 (IDEXX﹚ 公司生产的ELISA 抗体检测方法相比, 检测结果具有较高的可重复性、 真实性和稳定性, 可用于临床样品的检测。

CSF 和 PR 是我国优先防治和净化的病种, 检测方法和检测试剂的选择尤为重要。 本试验中的 Wellray CSFV 和 PRV 抗

体 LFICA 快速检测方法以双抗原夹心法为基础, 采用微瑞高敏荧光层析技术快速测定样本中的抗体含量, 通过 WellRay APP/PC 软件操作 WellRay 高敏荧光仪在 15min 内即可完成检测。与进口试剂盒 (如 IDEXX 的 ELISA 抗体检测试剂盒﹚ 相比成本低廉, 操作简便, 时间较短, 无须昂贵复杂的仪器设备, 更适合于基层兽医机构、 养猪场的使用, 在大规模样品检测中也更有优势。RR

参考文献:

[1] 赵德明,张仲秋,周向梅,等主译.猪病学 (第10版) [M].北京:中国

农业大学出版社,2014.

[2] 李春芬,李东风,李郁,等.2013—2017 年安徽省部分猪场伪狂犬病血清学调查 [J] .养猪,2019 (1) :113-115.

[3] 王泽州,王琴,赵启祖,等.猪瘟抗体镧系荧光免疫层析法的建立 [J] .四川畜牧兽医,2018 (6) :26-29.

[4] 吴泰相,刘关键,王家良.医学检验方法学研究的设计和文献评价原则[J] .中华检验医学杂志,2000,23 (6) :379-380.

[5] 詹思延主编.流行病学 (第 8 版) [M] .北京:人民卫生出版社,2017.

[6] 段博芳,李锡慧,肖荣海,等.2 种小反刍兽疫病毒 C-ELISA 抗体检测试剂盒的比较和分析 [J] .中国动物传染病学报,2019,27 (1) :90-95.