猪肺炎支原体灭活疫苗相对效力值竞争ELISA检测方法的建立
北京景达医疗器械有限公司;兆丰华生物科技(南京)有限公司生物医药科技中心;中国农业大学动物医学院
- 摘 要：
- 为了建立猪肺炎支原体灭活疫苗相对效力值竞争ELISA检测方法,试验以猪肺炎支原体全菌体为包被抗原,以抗猪肺炎支原体高免血清为检测抗体,建立猪肺炎支原体竞争ELISA抗原检测方法,并验证方法的灵敏度、特异性,再根据量反应平行线测定法原理建立猪肺炎支原体灭活疫苗相对效力值检测方法,并考察方法的批内和批间重复性.结果 表明:建立了猪肺炎支原体竞争ELISA反应体系,包被抗原浓度为32 μg/mL,阳性血清稀释度为1∶25000,阴性血清稀释度为1∶320;封闭液为5%脱脂奶粉,封闭时间为1.5h;酶标二抗稀释度为1∶20000,作用时间为1.5h;TMB显色时间为室温15 min;试验成立条件为阳性血清OD450值0.7~2.0,阴性血清OD450值<0.3;该方法线性相关系数为0.9955,线性范围为10~1280 μg/mL,与猪细小病毒、猪流感病毒、猪鼻支原体等8种异源蛋白无交叉反应.在猪肺炎支原体竞争ELISA抗原检测体系的基础上成功建立了灭活疫苗相对效力值检测方法,该法的批内变异系数<5%,批间变异系数<10%;该方法检测的相对效力值与动物免疫攻毒保护试验结果呈正相关.说明本试验所建立的猪肺炎支原体灭活疫苗相对效力值竞争ELISA检测方法可以用于测定猪肺炎支原体灭活疫苗免疫效力,替代动物试验检测.
关键词：猪肺炎支原体;灭活疫苗;竞争ELISA;相对效力值;平行线测定法;替代检测
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