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禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒二重荧光LAMP检测方法的建立及应用

作者：

张民秀;谢芝勋;谢志勤;谢丽基;张艳芳;邓显文;曾婷婷;范晴;罗思思;黄娇玲

单位：

广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室

关键词：

禽白血病病毒（ALV）;鸡传染性贫血病毒（CIAV）;二重荧光LAMP;探针;特异性;敏感性;

摘要：

【目的】建立同时鉴别ALV和CIAV的二重荧光环介导等温扩增（LAMP）检测方法,为临床上快速诊断及有效防控ALV和CIAV的单一或混合感染提供技术支持。【方法】参考ALV（A亚群、B亚群、C亚群、D亚群和J亚群）的pol基因和CIAV的VP2基因保守序列,设计2套用于LAMP的特异性引物,并在ALV和CIAV的F1c和B1c覆盖区域分别设计双标记探针[ALV-Probe（5’端标记FAM荧光基团,3’端标记BHQ3淬灭基团）和CIAV-Probe（5’端标记CY5荧光基团,3’端标记BHQ3淬灭基团）]。在Loopamp LA-320C实时浊度仪中反应结束后,将反应管置于多色荧光系统内进行观察分析;并通过特异性试验、灵敏度试验及临床样品检测验证二重荧光LAMP检测方法的适用性和可靠性。【结果】优化后的二重荧光LAMP反应体系20.0μL:DNA/cDNA模板2.0μL,2×Reaction Mix 10.0μL,Bst DNA聚合酶0.8μL,内引物ALV-FIP、ALV-BIP、CIAV-FIP和CIAV-BIP（工作浓度40.0μmol/L）各0.8μL,外引物ALV-F3、ALV-B3、CIAV-F3和CIAV-B3（工作浓度5.0μmol/L）各0.4μL,ALV-Probe（工作浓度0.5μmol/L）0.4μL,CIAV-Probe（工作浓度0.5μmol/L）0.8μL,以ddH₂O 补足至20.0μL。扩增程序:62℃反应60 min,80℃灭活5 min。建立的二重荧光LAMP检测方法能特异性同时检测ALV和CIAV,对其他禽类病原体无特异性扩增;检测CIAV和ALV单一模板的下限均为10²拷贝/μL,检测混合模板时ALV的检测下限为102拷贝/μL、CIAV的检测下限为10³拷贝/μL。应用建立的二重荧光LAMP检测方法对13份咽喉和泄殖腔棉拭子样品进行检测,其检测结果与常规PCR检测结果的吻合率达100%。【结论】建立的二重荧光LAMP检测方法能实现在同一反应管内鉴别诊断ALV和CIAV,具有特异性好、敏感性高及污染风险小等优点,且检测结果可通过多色荧光系统进行肉眼观察,适用于ALV和CIAV的临床快速筛查。

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