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Position: Home > Articles > Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of antifreeze protein gene AFP4 in Pacific cod Gadus macrocephalus Journal of Dalian Ocean University 2017,32 (2) 127-133

太平洋鳕抗冻基因AFP4的原核表达及多克隆抗体的制备

作  者：
吕绘倩;蒋洁兰;姜志强;毛明光
单  位：
大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室辽宁省北方鱼类应用生物学与增养殖重点实室
关键词：
太平洋鳕;抗冻基因;原核表达;抗体
摘  要：
为进一步研究太平洋鳕Gadus macrocephalus抗冻蛋白AFP4的功能,通过RT-PCR方法克隆得到太平洋鳕4型抗冻蛋白基因(AFP4)的开放阅读框(open reading frame,ORF),构建原核表达载体并优化表达条件,利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的效价,用Western-blot法分析重组蛋白的免疫原性。结果表明:AFP4基因编码区长度为375 bp,编码125个氨基酸;将AFP4基因的ORF与载体p ET-32a连接,构建重组体p ET-32a-AFP4,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中;经诱导、表达和条件优化,发现该重组体在37℃、0.01 mmol/L IPTG条件下诱导3 h获得最大的表达量;对该重组蛋白进行纯化,利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测该抗体效价为1∶1 600 000;Western blot分析显示,重组蛋白可以与兔抗AFP4多克隆抗体发生特异性结合,表明该重组蛋白具有免疫原性。本研究结果可为深入研究太平洋鳕AFP4蛋白功能提供理论依据。
译  名：
Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of antifreeze protein gene AFP4 in Pacific cod Gadus macrocephalus
作  者：
L Hui-qian;JIANG Jie-lan;JIANG Zhi-qiang;MAO Ming-guang;Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Key Laboratory of Fish Applied Biology and Aquaculture in North China,Liaoning Province,Dalian Ocean University;
关键词：
Gadus macrocephalus;;antifreeze gene;;prokaryotic expression;;antibody
摘  要：
The open reading frame(ORF) of type Ⅳ antifreeze protein was cloned from Pacific cod Gadus macrocephalus using RT-PCR to investigate the function of type Ⅳ antifreeze protein. The result showed that the ORF of AFP4 had 375 bp in length,encoding a polypeptide of 125 amino acids. The recombinant p ET-32a-AFP4 was constructed by linking the AFP4 ORF with the p ET-32 a vector,and transformed into Escherichia coli BL21(DE3).The expressing conditions of the recombinant plasmid were optimized under various concentrations of thermal hysteresis protein(THP),induction time and temperature with the optimal expressing induction conditions of 0. 01mmol/L IPTG,3 h and 37 ℃. The recombinant protein was purified and used to immunize New Zealand white rabbit. The polyclonal antibody was obtained and tested using indirect ELISA,with the titer of 1 ∶ 1 600 000. The specific binding between recombinant protein and Rabbit anti-AFP4 polyclonal antibody indicated that the recombinant protein had high immunogenicity. The findings will provide the foundations for further understanding of AFP4 functions in Pacific cod.

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