摘 要：
水稻细菌性条斑病主要分布在热带稻作区,我国的华南、华中、华东等地区均有发生,是重要检疫对象。随着杂交水稻的推广、种子南繁和调运,我省发病地区逐年增加。在种苗的检测上,血清学技术已广泛应用于植物病毒如TMV、CMV、PVX、PVY、RMV、TuMV、GFV等的检测。在植物细菌方面,张成良成功地应用抗血清检测了玉米细菌性枯萎菌,王法明、许志刚、高锦梁等进行了水稻白叶枯病菌血清型等的研究,赖文姜、陶家风、种藏文、秦文胜和王公金等分别进行了水稻细菌性条斑病种于检测研究。1988—1990年,我们对水稻细菌性条斑病进行了血清学检测技术的研究,现总结如下。 一、材料和方法 1.供试菌株 供试菌株共171、,分属于5个不同的属。其中水稻细菌性条斑病菌(Xantllomola‘”amPestr。s nv.cry。。cola)11个菌株,水稻白叶枯病菌(X.euroPe。tr。s pv。,y。ae)、柑桔溃疡病菌(X.I。xr.c。tr。)、马铃薯环腐炳菌(Co,yn’bact。,。urn s。pCbon;c。m)、番茄青枯病菌(Pse。domo。as solanaccar。m)、As,叨acte,。。。sP.和E,。。。7a sn.各 1个。 2.免疫原制备 用作免疫家兔的抗原有水稻细菌性条斑病菌株I(湖南茶陵)和菌株皿(广西白色地区),分别在523培养基上和朋℃恒温条件下培养24—72小时,生理盐水洗下菌苔,加灭菌玻璃球振荡打碎菌块,4000tPm离心10分钟,洗涤一次后用无菌生理盐水配成3x10’cell/ml(麦克法仑比色法)的菌悬液。菌株1以活细胞为免疫原,菌株了用热处理(100CC水浴灭活1小时)的灭活细胞作兔疫原,制备抗血清。 3.抗血清的制备 免疫家兔采用耳静脉注射,免疫程序见表1。末次注射后一周耳静脉采血。免疫小鼠采用肌肉和皮下多点注射,每次每只剂量0.2毫升,免疫原是菌株1的全细胞,共免疫4次,间隔15天,末次注射后一周眼球采血。血液于37C下过夜,低速离心析出血清,加0。01%的NaN。防腐,保存于一30ny条件下备用。 4.植物样品的处理 (1)稻种:取自湖南省望城、安仁、泪罗、衡南及海南省三亚的病稻种(包括田间自然发病和人工接种发病)、无病稻种及无病区稻种各1一5克,按人:V叫:5的比例加PBS,于37C水浴中浸泡卫小时或室温浸泡4小时,取上清液作待检抗原进行间接酶联兔疫试验(I-ELISA);或将样品磨成匀浆,8000rPm离心 6分钟,沉淀用PBS悬浮后普通滤纸过滤,取滤液作异种动物双抗体夹心酶联免疫试验(DSM-ELISA)。 (2)稻种各部位:湖南茶陵和安仁的病稻种,剥出颖壳和糙米。湖南岳阳和海南三亚的病稻种,其糙米用灭菌刀片分成胚和胚乳。各个部位的样品分别取0.03—0.50克,按W:V=1:5一20的比例加**S浸泡,普通滤纸过滤,取滤液作待检样品,进行卜ELISA测定。 (3)病株;用湖南望城县1989年早稻(品种7307)田间自然发病植株的稻叶、稻秆和稻种作待检样品,处理同(2)。 (4)幼苗:用湖南衡南县1989年晚稻(品种汕优63)病稻种浸种催芽后所长成的稻苗,取其胚芽、胚根和整株幼苗作供试材料,样品处理同(2)。 (5)花器:取望城1989年早稻(7307)田间自然发病植株的花药、外颖、穗枝梗等材料,加**S研磨,处理同(1)。 5.血清学试验 (1)琼脂双扩散试验(ODD);用硼酸缓冲液将琼脂糖配成l%的琼脂凝胶(内含0.01%NaN。),铺在2.5 X 7.5平方厘米的载玻片上,琼脂厚2毫米,打成梅花形孔,孔距4毫米,孔径6毫米,中央孔加细菌悬浮液,周围孔加抗血清,在18t----*xxxx散40/J、时,观察结果。 (2)间接酶联兔疫吸附试验 36(I-ELISA):酶联反应板以 N。OH一乙醇液处理48小时后,用自来水冲洗干净,再用蒸馏水冲洗,晾干备用。辣根过氧化物酶标记物系卫生部北京生物制品研究所产品。具体操作按梁训生介绍的方法进行。 (3)异种动物双抗体夹心酶联兔疫吸附试验(DSM-ELISA):参照陆家汪的方法进行。 二、结累和分析 1.抗血清的效价和特异性测定 (1)抗血清的效价:用琼脂双扩散法测定了两种兔疫原制备的兔抗血清,其效价均为1:64,鼠抗血清的效价是1:128;工ELISA测定的两批兔抗血清的效价均为1:10’,鼠抗血清的效价是I:10’。 (2)抗血清与不同属病菌的反应特异性比较:菌株工的全活细胞、菌株皿的热灭活细胞作免疫原制备的两批兔抗血清(浓度二。1000)和菌株1全活细胞作免疫原制备的鼠抗血清(浓度1:15加),除与水稻白叶枯病菌存在交叉反应以外,均只和细菌性条斑病菌产生明显阳性反应(P/N>.5为阳性),和其它属的细菌均呈阴性反应,说明这些抗血清能特异性地区分除水稻白叶枯病菌以外的各种植物病原细菌。三种抗血清的血清学反应无实质性差异,具有相似的特异性,只是与相同抗原反应时的P/N值(样品492urn的光吸收值/阴性对照492urn的光吸收值)略有差异(表2)。 (3)不同地区水稻细菌性条斑病菌的血清学反应差异比较:来自不同地区的11个细菌性条斑病菌株(浓度为lx10‘’cell/m!),与茵株1的全活细胞为兔疫原制备的兔抗血清作 I-ELISA测定,结果(表 3)显示反应存在强弱不同的差异。王法明、许志刚等的研究证明,水稻白叶枯病菌存在着不同的血清型。我们认为,细菌性条斑病菌也可能存在着不同的血清型。 2.ELI“检测灵敏度试验 纯培养细菌性条斑菌经系列倍比稀释后表2抗血清与植物病原细菌反应的P/N值(卜ELISA)“A.Py.yltflPseudomo。asCorvnebacterlumErwln。asolanacearuu一sP.?︽︽Wrprphtorydcyrp??︻pryed兔(活细胞)13.40 3.23 1.43 o兔(灭活纲胞)3.35.1011.30 0.90鼠(活细胞 I;4。。阴性对照是健帘兔(鼠)抗血清与人些竺些迫壬Jy.Oedap反。。病菌浓度均为 3 X 109cell/ml.表3“菌株I活细胞免疫原制备的抗血清与不同地区菌株的反应华南农大 福 建 农 科 院IRR广浙江宁晦 硼南芥陵I 西乙色I｛一lfi R一174 20 J 4.46R──193.91R──254.23R一274 40 R一1113.115/l/101/3/44 磕2口 互1 巨4.80 3.68 。Pseudomonas solanacearum为阴性对照,下同.与同源抗血清的反应结果,DSM-ELISA的检测灵敏度比 1-ELISA要高5—10倍,它们能检测出病菌的最低浓度分别是IX 10’cell/ml和 5—10 X 105Cell/ml。 3.ELISA检测植物样品中的病原细菌 (1)稻种:1988年I-ELISA检测茶陵、安仁的病种8份,无病种4份,结果呈阳性反应的有11份,呈阴性反应的1份,病种检出率为100%。1990年I-ELISA检测泪罗、望城、宁乡、衡南、长沙及海南三亚的病种160份(次),无病种20份(次),结果有6份(次)无病稻种呈阳性反应,8份(次)病种呈阴性反应,病种检出率为95%。1989年DSM-ELISA测试样品60份,其中有3份无病稻种,结果有5份病种呈阴性反应,3份无病种都呈阳性反应,病种检出率为gi.2%。 (2)稻种带菌部位:多次测定结果表明,病种的糙米和颖壳均能测出病菌,且糙米的带菌量略高于颖壳。将糙米分成胚和胚乳分别检测,则胚呈强阳性反应,胚乳呈弱阳性或阴性反应(表4)。据此,我们初步认为,稻种的主要带菌部位是胚部。 (3)病株各部位相对含菌量:用 表4 稻种带菌部位测定(卜ELISA) 结果(P/N值) I稻种D颖壳DM米D 胚DEfL2.28 11.82. totowto ol pechtol ～ ac rol eqededl?? 回??LO(1:20 J t。。。’”““’“”“1.64dto口o @回??喇且 了?? ..??陵 仁 阳 阳 亚茶 安 岳 岳 三 .wl*一1:川.夫加注明者均为w:V一1:5I-ELISA和DSM-ELISA法测定“7307”病株、病叶、病稻秆和病稻种,结果以病叶中病菌含量最高,病稻秆次之,病稻种的含量最少,但都呈明显阳性反应。 (4)病种育成的幼苗带菌情况:汕优63病种育成的幼苗,胚芽呈阳性反应(P/N=2.13),胚根和整株胚苗呈阴性反应(P/N=1.44),说明胚芽是带菌的主要部位。整株稻苗虽然带菌,但含量极少,用ELISA尚不能检测出来,也进一步支持了病种育成的秧苗不一定显症的试验结果。 (5)花器带菌情况:用DSM-ELISA法测定的结果是,花器基本上被病菌污染,尤以花药含量最高(表5)。这与病种中以胚为主要带菌部位的结果相吻合。 37 三、讨 论 1.关于交叉反应问题。陶家民用酶联间接法和双夹心法能特异性地区分水稻细菌性条斑病菌和水稻白叶枯病菌,但和柑桔溃疡病菌呈弱交叉反应;刘建华报道了柑桔溃疡病菌抗血清、水稻白叶枯病菌抗血清都只与同源抗原发生反应,二者之间不存在交叉反应。我们用上述相同的检测方法进行试验,其结果是:细菌性条斑病菌和白叶枯病菌有交叉反应,而和柑桔溃疡病菌无交叉反应。王公金应用水稻白叶枯病菌纯培养处理细菌性条斑病菌抗血清,把交叉反应控制在5%以下。我们的试验未能重复其结果。曹景显认为对水稻细菌性条斑病菌进行加热固定,Wakimoto S.等加热灭活Pseudo。onosel。moe(水稻粒腐病原菌),能提高抗血清的特异性,减少交叉反应。但我们用水稻细菌性条斑病菌的热处理和不处理两种免疫原制备的抗血清,特异性相似,都未能消除与白叶枯病菌的交叉反应。秦文胜所建立的杂交瘤细胞株产生的单抗也存在交叉反应现象。据Ss 11gs上的研究报道,过两种病菌亲缘关系极近,抗原成分几乎相同,用多抗血清难以区分这两种病原菌。因此,在免疫原的选择和处理方法上,有待进一步研究。 2.关于病种带菌的部位。我们反复试验的结果表明,病种的主要带菌部位是胚部。赖文姜也以米粒作待检样品进行检测,Sharada M/.等人的研究结果是,随水稻品种而异,种子内部的细菌数量是种于表面细菌数量的3.5—53倍。这些研究结果与我们的试验结果相吻合。但王公金等则认为米粒带菌显著低于颖壳部位,伍尚忠认为水稻白叶枯病病种的主要带菌部位是颖壳。这可能是病菌侵染的时期和部位不同所致。 3.ELIS人检测稻种对,出现了病区部分病种呈阴性反应,病区无病种子和部分无病区稻种(健康种于对照)呈阳性反应的结果。这可能是病田中虽有植株发病,但种子未受感染的缘故,或虽感染,但带菌量太少、达不到ELISA检测的最低菌量,故检测时表现阴性反应。而病区有些植株是隐症带菌者,故不发病。同样,无病区也可能个别植株感染到病菌而表现阳性反应。据介绍,用噬菌体检测东北无病区稻种时,有许多稻种表现阴性反应。D.K.Bordloi研究认为,白叶枯病的感病品种和病菌菌株间有密切的血清学关系,而抗病品种和病菌菌株间无血清学关系。对水稻细菌性条斑病来说,这种奇主与病菌的关系也可能存在。因此,无病种子呈阳性反应,也可能与品种的抗性有关。水稻细菌性条斑病菌血清学检测技术研究@李爱贞$湖南省植保所
@李宣铿$湖南省植保所
@张晓葵$湖南省植保所
