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当前位置: 首页 > 文章 > 双孢蘑菇RAPD-PCR反应体系的优化 食品科学 2008,29 (10) 428-432
Position: Home > Articles > Optimization of RAPD-PCR Detection System for Agaricus bisporus FOOD SCIENCE 2008,29 (10) 428-432

双孢蘑菇RAPD-PCR反应体系的优化

作  者：
陈文炳;林媛;王泽生;邵碧英;廖剑华;李寿崧;江树勋;林河通
单  位：
福建农林大学金山学院;福建出入境检验检疫局技术中心;福建农林大学食品科学学院;福建省蘑菇菌种研究推广站
关键词：
蘑菇;RAPD-PCR;体系优化
摘  要：
本研究对6个影响双孢蘑菇RAPD-PCR反应的关键因素进行了一系列优化,目的在于建立理想的RAPD最佳反应条件和反应体系,为大量双孢蘑菇品种间的RAPD多样性分析做准备。各关键因素梯度设置如下:(1)7个退火温度梯度:33.5、36.5、38.3、40.1、43.7、45.4、48.1℃。(2)6个Mg2+浓度梯度:0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3mmol/L。(3)5个Taq酶用量梯度:0.5、1.0、1.5、2.0、2.5U。(4)5个dNTPs浓度梯度:0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mmol/L。(5)5个引物浓度梯度:0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μmol/L。(6)7个模板DNA用量梯度:100、20、4、0.8、0.16、0.032、0ng。实验结果表明:最佳的RAPD反应体系为:10×buffer2.0μl、Taq酶1.5U、模板DNA4-100ng、MgCl22.0mmol/L、dNTP0.20mmol/L,引物0.3μmol/L,加ddH2O至20μl。PCR热循环参数为94℃预变性5min;94℃变性1min,44℃退火1min50s,72℃延伸2min,循环40次;最后72℃延伸7min。
译  名：
Optimization of RAPD-PCR Detection System for Agaricus bisporus
作  者：
CHEN Wen-bing1,LIN Yuan2,WANG Ze-sheng3,SHAO Bi-ying1,LIAO Jian-hua3,LI Shou-song1,JIANG Shu-xun1,LIN He-tong4 (1.Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Fujiang Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research,Fuzhou 350001,China;2.Jinshan College,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China;3.Fujian Mushroom Research and Development Station,Fuzhou 350003,China;4.College of Food Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)
关键词：
Agaricus bisporus;RAPD-PCR;system optimization
摘  要：
Six key effect factors to RAPD-PCR including Taq enzyme dosage,template DNA dosage,magnesiumion concentration,dNTPs concentration,arbitrary primer concentration and annealing temperature were optimized one by one,in order to establish the optimal RAPD-PCR system for RAPD diversity analysis among some varieties of Agaricus bisporus. The gradient treatments of the six factors were established as follows:(1) 7 gradient annealing temperatures 33.5,36.5,38.3,40.1,43.7,45.4 and 48.1℃; (2) 6 gradient concentrations of magnesiumion 0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 and 3 mmol/L; (3)5 gradient dosage of Taq enzyme 0.5,1.0,1.5,2.0 and 2.5 U; (4) 5 gradient concentration of dNTPs 0.10,0.15,0.20,0.25 and 0.30 mmol/L; (5) 5 gradient concentration of primers 0.1,0.2,0.3,0.4 and 0.5μmol/L; (6) 7 gradient dosage of template DNA with 100,20,4,0.8,0.16,0.032 and 0 ng.The results showed that 20μl volume of the reaction system consists of 2.0μl 10×buffer,1.5 unit Taq DNA enzyme,80 ng template DNA,2.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L is dNTPs,0.3μmol/L arbitrary primer,adding ddH2O to 20μl final volume. The thermal programmer of RAPD-PCR is 5 min denaturation at 94 ℃,then 1 min denaturation at 94 ℃,1 min annealing at 44 ℃,1 min 50 s polymerization at 72 ℃,for 40 cycles,and final polymerization at 72 ℃ for 7 min.

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