杀鱼爱德华氏菌PPD130/91(Edwardsiella piscicida PPD130/91), 是一种革兰氏阴性胞内致病菌, 其感染造成易感鱼类出血性败血症(Hemorrhagic septicemia)。杀鱼爱德华氏菌感染宿主范围广, 对牙鲆和大菱鲆等经济鱼类的感染给水产养殖业造成巨大经济损失^[1]。研究杀鱼爱德华氏菌与宿主之间的互作机制对预防爱德华氏菌感染策略的提出具有重要的理论指导意义。

在研究杀鱼爱德华氏菌-宿主互作过程中, 往往涉及病原菌基因敲除或者毒力蛋白抗体的使用。在动物中制备细菌蛋白的抗体耗时长, 且获得的多克隆或多肽抗体在真核宿主细胞中特异性差, 背景信号强。传统的自杀质粒介导的基因缺失和基因组标签序列添加的操作步骤多、耗时长。λ Red重组系统通过线性片段同源重组的方法实现对靶基因的操作, 已经被广泛应用于大肠杆菌基因敲除、基因替换和基因组基因标签序列的添加^{[2, 3]}。该系统由λ噬菌体衍化而来, λ噬菌体主要由exo、beta和gam三个基因编码^[4]。Exo蛋白行使5′—3′核酸外切酶功能, 从DNA双链的5′端向3′端降解DNA; Beta为一个单链DNA结合蛋白, 介导单链DNA退火; Gam蛋白与RecBCD核酸外切酶结合, 抑制其对外源DNA的降解^[5]。pKD46携带exo、beta和gam三个基因, 这3个基因受L-阿拉伯糖启动子控制, 经诱导可表达Exo、Beta和Gam^[5]。pKD46携带温度敏感型复制子, 在37℃培养条件下该质粒会逐渐丢失。pKD3/pKD4质粒模板分布有两个FRT位点, 两位点之间为抗生素抗性基^[6]。pSU312/pSU313(Flag)、pSU314/pSU315(HA)和pSUB7(His)是以pKD3/pKD4为基础改造的携带不同标签序列的质粒模板^[7]。以带有标签序列的质粒为模板进行扩增, 通过λ Red重组可以获得引入抗生素抗性的靶基因添加标签序列的菌株。pCP20携带FLP重组酶基因, 在FLP重组酶作用下两个FRT位点发生同源重组, 可消除一个FRT位点和引入的抗生素抗性基因^[2]。引入至病原菌的pCP20携带温度敏感型复制子, 在42℃培养条件下, 该质粒逐渐丢失, 实现病原菌基因敲除、基因替换或基因组基因标签序列的添加。

λ Red重组系统被广泛应用于人类病原细菌基因的缺失和标签序列的添加, 如致病性大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella), 以及志贺氏菌(Shigella)^[8－10]。λ Red重组技术也开始被应用在爱德华氏菌研究中^{[11, 12]}, 但未涉及操作步骤的详细描述, 且构建的菌株引入了两个FRT位点, 使得同一菌株中无法进一步使用λ Red重组法进行下一个基因的敲除或标签序列的添加。传统λ Red重组系统中的pCP20温敏型质粒需要在42℃条件下脱质粒, 但杀鱼爱德华氏菌在42℃不生长。本研究以pCP20质粒上的FLP重组酶基因替代pKD46质粒上的exo、beta和gam三个基因, 获得pKD46-flp质粒, 在FLP重组酶的作用下, 对杀鱼爱德华氏菌中引入的抗生素抗性基因及一个FRT位点进行消除, 为同一个菌株基因组中其他基因的敲除或标签添加铺平道路。本研究通过对 λ Red重组系统进行优化, 使其适用于水产动物重要病原菌——杀鱼爱德华氏菌, 亦为其他水产动物病原细菌的遗传操作提供借鉴, 为水产动物病原细菌基因功能研究提供便利。