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家蚕抗BmNPV细胞因子的筛选和分析

作  者:
王菲;李显扬;化晓婷;夏庆友
单  位:
西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室
关键词:
家蚕;家蚕核型多角体病毒;Bm Relish;细胞因子;抗病毒免疫
摘  要:
【目的】探讨家蚕NF-κB类转录因子Bm Relish在抗核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)感染的免疫应答中的作用,筛选和分析抗病毒细胞因子,完善对家蚕抗病毒免疫机制的认识。【方法】通过Western blot检测当Bm NPV感染家蚕Bm E细胞后Bm Relish全长形式(Bm Relish-FL)是否转变成其活性形式(Bm Relishact);利用荧光定量PCR检测过表达Bm Relishact的细胞在感染Bm NPV后胞内病毒DNA的相对水平,观测在被荧光标记的Bm NPV(Bm NPV-EGFP)感染后呈现EGFP荧光的细胞数,并与作为对照的未表达Bm Relishact的细胞相比较,以确定Bm Relish是否参与抗病毒免疫;将新鲜细胞通过Transwell细胞共培养体系经过表达Bm Relishact的细胞上清培养液孵育后,定量检测在感染Bm NPV后胞内病毒DNA的相对水平,以探讨过表达Bm Relishact的细胞是否产生并分泌抗病毒细胞因子;通过超滤等方法对过表达Bm Relishact的细胞上清培养液予以初步分离,将滤过液和截留液分别孵育新鲜细胞,定量检测感染Bm NPV后胞内病毒DNA的相对水平,从而确定抗病毒细胞因子的分子量范围;用高温处理滤过液和截留液后再孵育新鲜细胞,定量检测感染Bm NPV后胞内病毒DNA的相对水平以确定抗病毒细胞因子的属性;利用LC-MS/MS对滤过液中的多肽做进一步鉴定和分析。【结果】Bm E细胞被Bm NPV感染后,部分Bm Relish-FL转变成其活性形式Bm Relishact;过表达Bm Relishact的细胞被Bm NPV感染后,胞内病毒DNA的相对水平显著低于对照细胞,且呈现EGFP荧光的细胞数也较对照少;新鲜细胞经过表达Bm Relishact的细胞上清培养液孵育后,胞内病毒DNA的相对水平显著低于用对照细胞上清培养液孵育的细胞;用100和3 k D超滤管超滤过表达Bm Relishact的细胞上清培养液后,滤过液仍然具有显著降低所孵育细胞的胞内病毒DNA的相对水平,而截留液无此活性;经高温处理后,该细胞上清培养液不再具有降低所孵育细胞的胞内病毒DNA相对水平的作用;在滤过液中通过质谱鉴定到67个肽段,长度为9—45个氨基酸,富集到32个蛋白质,分子量均>3 k D,其中9个蛋白质含有信号肽。【结论】Bm NPV感染导致Bm Relish的激活;活化的Bm Relish促进细胞产生抗病毒细胞因子并分泌到上清培养液中;该细胞因子具有增强细胞抗病毒能力的活性,为分子量<3 k D的多肽。
译  名:
Screening and Analysis of Anti-BmNPV Cytokines in Silkworm(Bombyx mori)

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