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表达非洲猪瘟病毒p54蛋白重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定

作  者:
何兴林;邹忠;龚文孝;张宇飞;李成飞;徐婷;陈焕春;金梅林
单  位:
农业微生物学国家重点实验室;武汉科前生物股份有限公司
关键词:
非洲猪瘟病毒(ASFV);伪狂犬病病毒(PRV);p54蛋白;
摘  要:
试验旨在构建能高效表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)p54蛋白的重组伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)。通过无缝克隆构建含有PRV TK基因同源臂和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的PRV通用转移载体pCAGIG-TK(l+r),参考China/2018/AnhuiXCGQ株基因序列,优化合成E183L基因,并连入通用转移载体,构建重组中间转移质粒pCAGIG-TK(l+r)-p54;重组质粒ScaⅠ酶切线性化后经脂质体介导转染BHK-21细胞,6 h后感染0.1个感染复数(MOI) PRV变异株,出现病变后通过空斑挑选和PCR鉴定纯化重组PRV,进一步通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)检测外源蛋白表达,并对重组病毒的遗传稳定性和增殖特性进行研究。结果显示,转染重组质粒pCAGIG-TK(l+r)-p54的BHK-21细胞24 h后可观察到绿色荧光,说明重组质粒成功转入BHK-21细胞;纯化后的重组病毒表达绿色荧光蛋白且含有ASFV E183L基因,Western blotting和IFA结果证实重组PRV在BHK-21细胞中能表达p54外源蛋白,在26 ku处呈现特异性条带,且能与ASFV阳性血清发生特异性反应,免疫原性较好;重组病毒在BHK-21细胞上连续传代20次均能检测到ASFV E183L基因,遗传稳定性较好;一步生长曲线显示,重组病毒与亲本病毒的增殖特性差异不大,且二者的最高病毒滴度分别为107.34/0.1 mL和107.61/0.1 mL,外源片段的插入不影响重组病毒在细胞上的增殖能力。本研究成功获得了表达ASFV p54蛋白的重组病毒rPRV-p54,为进一步研究p54蛋白的免疫原性及开发非洲猪瘟多基因重组PRV载体疫苗奠定了基础。

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