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小反刍兽疫病毒C蛋白在外周血单个核细胞中的过表达及鉴定

作  者:
苏乾隆;赵帅阳;蒙学莲;朱学亮;李彦敏;孙跃峰;张志东
单  位:
中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室;西南民族大学畜牧兽医学院;家畜疫病病原生物学国家重点实验室
关键词:
小反刍兽疫病毒;非结构蛋白C;慢病毒;外周血单个核细胞;
摘  要:
为探索小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)非结构蛋白C(PPRV-C)的功能及其调节宿主细胞免疫抑制的分子机制,首先根据GenBank中PPRV-C蛋白基因序设计引物,通过PCR扩增获得PPRV-C蛋白基因,将其克隆至慢病毒载体PLVX-IRES-puro上,并命名为PLVX-IRES-puro-PPRV-C,随后连同辅助质粒共同转染HEK-293T细胞,收集上清,浓缩后测定重组慢病毒效价。用包装好的重组慢病毒感染绵羊外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)12 h后,换维持液继续培养,一定时间后收集细胞,检测PPRV-C的mRNA和蛋白表达水平;同时用空载体慢病毒做空白对照。结果显示:成功地构建了PPRV-C蛋白过表达重组慢病毒载体,包装的重组慢病毒效价为(9.6±8.8)×107TU/m L。重组慢病毒感染(MOI=10)后,检测到PPRV-C蛋白mRNA的转录和蛋白的表达结果表明,构建的PPRV-C慢病毒能在PBMCs中高效表达,同时也为今后进一步研究PPRV-C蛋白的功能奠定了基础。

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