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China Animal Husbandry & Veterinary Medicine
2020
(4)
984-991
转座酶Tn3体外定向进化和酶活力提高方法的建立
作 者：
宋尚桥;马围围;李晓剑;曾素先;李鑫;严瑾;孙翠翠;黎宗强
单 位：
广西大学动物科学技术学院
关键词：
Tn3;易错PCR;DNA重排;定向进化;酶切产物;基因序列
摘 要：
试验旨在对转座酶Tn3的酶活力提高和进化进行初步探索.采用PCR扩增、限制性酶切、DNA连接、重组质粒的转化、易错PCR的优化及构建、D值的测定、酶切鉴定方法对转座酶Tn3进行体外定向进化研究.结果表明,用SacⅠ和XbaⅠ对重组质粒进行酶切,得到了450 bp的酶切产物;在含有卡那霉素的LB培养基培养菌体24 h,测量其D值,经过3轮重复性的研究,其D值和增殖能力从开始的0上升至0.18、0.42、0.60,说明Tn3活性有了明显的提高;将筛选得到的进化型重组质粒进行质粒抽提,用内切酶XhoⅠ和XbaⅠ进行双酶切鉴定,发现进化型重组质粒酶切产物条带相对较小;之后对进化型重组质粒进行基因测序分析,发现Tn3基因序列的多个位点发生了突变以及Tn3-Gal4靶向序列中间的CCR5-delta32基因被切除.说明成功完成了转座酶Tn3基因的克隆;确立了易错PCR的最优反应体系;选择卡那霉素作为筛选标记对进化型Tn3进行筛选,初步验证利用含有卡那霉素的LB培养基和对菌液D值的测定来进行筛选是可行的;Tn3基因序列突变和基因敲除,说明不论是在功能上还是在基因序列上Tn3都发生了改变,这种变化正是向着需要的方向进行的.
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