摘 要：
一、前言 水稻化学杀雄早在五十年代国外已有报道。国内自七十年代起,广东、湖南、山东、浙江、江西等省先后开展了化学杀雄研究,并筛选出了若干化杀药剂,如甲基砷酸锌(杀雄剂1号),甲基砷酸钠(杀雄剂II号)和氨基磺酸钙等。与此同时,对化杀药剂导致雄性不育的机理,曾就遗传学、细胞学、解剖学和生理生化等方面进行了研究,发现杀雄药剂与遗传因素引起的雄性不育,在物质和能量代谢方面,有不少相似之处。 杀雄剂1号诱导水稻雄性不育机理研究表明,喷药后能迅速运往穗部,使花药中流基(-SH)活性受抑制,琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶及ATP酶活性下降,雄蕊发育过程中正常的呼吸代谢受到破坏,能量代谢发生障碍,同时花药中游离脯氨酸(蛋白质含量都明显减少,致使花粉丧失萌发力或花粉管不能伸长,导致不育。 迄今为止,有杀雄作用的化合物有40多种,目前常用的几种化杀药剂存在以下主要问题:(1)杀雄的选择性不够强,影响制种产量;(2)使用的剂量和用药时期波动幅度小,用药技术难以掌握;(3)大面积制种纯度和产量不稳定;(4)有一定的残毒污染环境和种子。据此,我们从1982年开始研制无毒杀雄剂,益先后在湖南长沙、平江、常德、汉寿和广东海南岛等地对水稻进行了多次盆栽试验和大田试验,初步筛选出复合配方的 N—312和HAC—123两种具有较好效果的无毒杀雄剂,经过三年多反复试验,对40多个品种杀雄率达到90—100%,异交结实率一般为70—80%,高的近90%,为了对更多的品种杀雄有效,除了继续进行田间试验和制订规范化的药剂使用技术外,对杀雄机理还需进一步探讨. 二、实巴材料和方法 (一)供试品种及处理 品种. 79—1163、二九丰305。( 1)红优早制。前两个品种进行早季盆栽,对照和处理各20盆,每盆4苑,红优早舢则于大田种植,供试探喷药时期、喷药量及喷药次数之用。 药剂处理:杀雄药剂为N—312。(l)盆栽处理:在稻穗分化到第三期末至四期初时,进行第一次喷药。79—1163每苗喷药0.2ml,二九丰305每亩喷0.15ml,第二次喷药在稻穗分化第六期,喷施量与第一次相同。(2)大田处理:喷施剂量分三种:A( 0.lml/苗), B(0.15ml/苗), C(0.Zml/苗)。喷药时期作如下安排:皿(在三期末四期初只喷施·一次;V(在五期末六期初只喷施一次);皿(在七期末八期初只施一次);皿十y(在三期末四期初和五期末六期初各喷施一次),皿十皿(在三期末四期初和七期末八期初各喷一次)oV十皿(在五期末六期初和七期末八期初各喷一次)。每一处理都有A、B、*三种不同剂量。 (二)药剂杀雄效果观察 观察项目包括株型、叶色变化、分率、抽穗及开花习性、颖壳及雄蕊的形态等。开花后,取花粉分别用KI— I。和TTC染色。在显微镜下观察花粉的活力,对照和处理各检查4个视野,统计花粉着色的情况。开始抽穗时,对照和处理随机取20＄套袋,成熟后统计结实率。 (三)杀雄处理后的生化分析 1.“P的处理及测定:第二次喷施药剂的同一天,取对照和处理植株各4菇,移入盛有1000ml含’‘P的培养液水墙体中水培,每体中“P最初的总放射性强度为0.154met。第六天取样进行酸溶性“P、酯溶性’‘P、RNA—’‘P和DNA—“P的测定,取材部位为叶、茎和幼穗,每隔两天取样测定一次,共测四次。 2.蛋白质含量测定:从第二次喷药的第三天起,每隔两天取样一次,取样部位为叶和花药,共测定四次。称样100mg,研磨后,用碱性乙醇提取蛋白质,离心后,用紫外吸收法比色测定。 】 3.硼的测定:第二次喷药后第4天、8大、12大分别取样测定一次。 4.脯氨酸的测定:第二次喷药后第2天进行第一次取样。测定部位为叶及花药。以后每隔3天取样测定一次,共测三次。 5.可溶性糖含量测定:第一次喷药后第2天取样测定。以后每两天取样测定一次,共六次。取样部位为叶、茎、穗。 6.几种酶的组织化学鉴定:按郭季芳的方法进行。上午9时取即将开放的对照和处理穗上相同部位的颖花,作下列几种酶的组织化学鉴定:( l)过氧化物酶;(2)多酚氧化酶,(3)琅琅酸脱氢酶。 三、结果及分析 (一) N——312药剂的杀雄效果 用N—312杀雄剂处理的植株,剑叶出现明显的部分缺绿条纹,叶片有时有轻度扭曲。整个植株比对照稍矮,抽穗时有轻度卡颈现象,开花正常,有2—3%的颖壳畸变,雌蕊发育正常,雄蕊有少部分严重退化。用两种方法检查花粉活力的结果表明(见表1):对照有90%以上是全着色的,有6—8%是半着色的,不着色的只有l%左右,而处理全部着色的只有2—3%。通过对套袋和未套袋穗的考种调查(见表2),发现品种不同对该药物的反应程度也不同,M九丰305较敏感,两次喷药剂量较小,但杀雄效果都较好,杀雄率为93.96%,异交结实率为87.17%,但有轻度卡预和植株变矮的现象。79—1163对该药剂的抵抗力较强,两次用药总量为0.4ml/苗,杀雄率为78.5%. (。)不同喷药剂量、时期、次数的杀雄效果 在大田条件下,对品种红优早舢进行了不同喷药剂量、时期和次数的杀雄效果比较试验,其结果如表3。 由表8可以看出:(1)无论在哪个时期喷药,其杀雄率均随剂量的增加而提高,即C>B>乌(2)随喷药时期的提前杀雄效果而提高,即皿期>V期>皿期,(3)在两次喷药中,凡在稻穗分化第三期末四期初喷了第一次药物的,不论哪一个剂量水平,都比只喷一次药物的杀雄率要高,即皿十V和皿十VH的杀雄率均高于皿、V和皿。即使在喷药时期推后的情况下,两次喷药的杀雄效果也高于一次喷药的,如V+W的杀雄效果优于y和W;( 4)无论哪种处理,随着杀雄效果的提高,稻株受药害的程度有增大的趋势,但这个问题可采用其‘白辅助措施得到较好的克服。从植株形态、经济性状、杀雄效果等方面综合分析比较,N一312处理红优早at,以皿十皿期的B、C剂量的结果较为理想,若单从杀雄效果来看,见期的B、C剂量和皿十y的各个剂量均较好。 (三)药剂对“1的吸收运输和转化的影响 植株用N—312杀雄剂处理后,“P的吸收明显减少(见表4),药剂处理后的第2天取样测定,处理株“P放射性总强度为13751cPm,仅为对照24638cPnl的55.81%,随时间的推移,P”不断减少,到第11天测定时,处理株中’‘P的总量仅为对照的38.38%。由此可见,该药物严重阻碍了水稻对“P的吸收,造成了植株体内磷素的严重亏缺。 表5的结果表明,该杀雄剂还严重影响了磷素在植株各器官之间的正常运输和分配。从对照株来看,“P大量积累在穗部,’‘P处理后第11天穗中’‘P的量占,g“P的55.32%,药剂处理植株中’‘P大量积累在茎中,向穗中转移的量很少。仅占总“P的37.95%。以致无法满足幼穗正常的分化发育过程中对磷素的需求。 各器官中几类含磷化合物’‘ P总量的百分比如表6所示。表6表明:该药剂对’‘P在四类含磷化合物之间的分配影响不大,未严重阻碍这几类化合物的合成。但由于植株对’‘P的吸收有严重的阻碍,降低了“v在体内的总量,这几类化合物的含量亦随之下降,其中以DNA和RNA的减少幅度最大,在穗中RNA最少的要比对照少73.71%,DNA最少的要比对照少81.61%(见表7中第5天和第2天测定的结果)。 (四)药剂对花药中硼含量的影响 硼与花粉萌芽发及花粉管伸长有密切关系。从表8看出,经过施药处理后的花药,硼的含量比对照少55—50%。这说明该药剂导致不育的一部分原因是减少了花药中硼的含量。 (五)脯氨酸含量的变化 三次脯氨酸含量测定表明(见表9):第一次在穗分化六期末,比对照高39.32%I第二次约在第七期,比对照高 31. 36%;第三次在第八期,较对照高9.69%。通过杀雄刘处理后,花药中出现脯氨酸大量积累。叶中游离脯氨酸含量,处理和对照均低,且两者无明显差别,表明该杀雄刘业不影响叶中游离脯氨酸含量。 (六)药剂对可溶性糖含量的影响 叶、茎、穗中可溶性糖含量测定表明,处理植株的叶和茎中可溶性糖的含量比对照高(见表10)。穗中前四次测定的结果(即四期末到六期末),处理的可溶性糖含量比对照稍低;而从七期开始,处理德中可溶性糖增加,含量反比对照穗高。这表明该药剂干扰了糖的代谢。 (七)花药中几种酶活性的变化 用组织化学的方法对花药中城用酸脱氢酶、多酚氧化酶、过氧化物酶的活性进行检测的结果表明,处理花药中这三种酶的活性几乎丧失. 回、材租 1.水稻在幼穗的正常发育过程中,特别是花粉母细胞进行分裂时需要大量的磷素来合成DNA和RNA。但药剂处理后,由于植株吸收磷的总量显著减少,分配到叶和幼德中磷素的绝对量大大地少于对照(在幼稳中RNA最少的只有对照的29.67%, DNA只有对照的19.39%)。说明该杀雄剂阻碍水稻对磷的吸收和往生长部位的运输与分配,减少幼德中RrtA、DIVA、磷脂等含磷化合物的绝对量,严重地阻碍花粉的发育与形成. 2.在处理整中可溶性精含量比对照高很多,而幼德中的含量反而低于对照,说明精从室往穗部的运输发生了障碍。但幼穗发育到第七、八期时,处理穗中可溶性精含量却比对照高。说明运往穗部的可溶性糖未如正常情况那样合成淀粉,使花粉粒不充实,严重地影响了花粉的育性。 3.很多报道指出在不育花药中游离脯氨酸的含量很少,因此认为游离脯氨酸含量与花粉的育性有夫, TuPy和 Fujushita等干脆把花粉内游离脯氨酸含量作为育性的指标。另一些研究表明,在不利条件下,如微生物感染、大气污染、低温、盐渍或于旱等,植物体内发生游离脯氨酸的积累。也有人曾经把禾本科作物积累脯氨酸的能力作为抗性的指标。但Hansen,Ilahi等认为脯氨酸的积累既可能对逆境有适应性的作用,又可能是细胞结构和功能受到损伤的表现,我们用N—312处理的不育花药中出现游离脯氨酸积累,与前面提到的与育性关系刚好相反,而与在不利条件下的反应相似。 4.前人研究表明,不育花粉中蛋白质的含量低于可育花粉。本实验测定结果,经 药剂处理后,蛋白质的合成受到抑制,处理 的叶和花药中蛋白质含量少于对照,以花药 中最显著.这与脯氨酸的积累似乎有一定的 关系,因为脯氨酸在体内很容易转化成同族的其他氨基酸而参与蛋白质合成。脯氨酸大量积累的原因之一,可能就是蛋白质的合成受阻。 5.硼有促进花粉萌发和花粉管伸长的功能。硼与糟形成复合物可加速糖的运输。据报道,缺硼时油菜等作物出现不育。还使作物吸收磷的能力降低、蛋白质合成减少。本实验的结果表明,杀雄剂处理后不育花药中硼的含量只有正常的花粉的一半,花粉中含硼量大量减少,’‘P吸收总量下降,以及可溶性糖从茎往穗中的运输减少,这些与前人的报道是相符的。 6.德硝酸脱氢酶、多酚氧化酶是植物呼吸作用中两个重要的酶。据报道,水稻高粱雄性不育花药中的滤用酸脱氢酶的活性低于可育花药。本实验的结果也表明处理花药中瑰油酸脱氢酶和多酚氧化酶的活性明显低于对照,这必然影响花药的呼吸作用和花药发育过程中的能量供应,过氧化物酶是植物体中普遍存在的一种氧化还原酶,现在一般都把这种酶当成是植物遇到不良环境时的保护酶之一,它能将体内过多的过氧化氢,过氧化物分解利用掉,使植物兔受损害。用该杀雄剂处理后花药中几乎检测不到这种酶的存在,这样花药中累积的过氧化物必然会扰乱花药发育过程中的各种物质代谢,抑制花药的正常发育. 当然导致雄性不育的原因益非仅仅就是这些。而且原初引发与因果相关还不能十分肯定,有待作进一步的研究。无毒杀雄剂对水稻杀雄效果及机理分析@罗泽民$湖南农学院
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