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猪萨佩罗病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

作  者:
李倩倩;赵福杰;丁庆文;张云飞;郑兰兰
单  位:
河南农业大学动物医学院
关键词:
猪萨佩罗病毒;5’非编码区;TaqMan实时荧光定量PCR;河南
摘  要:
[目的]建立快速、特异、灵敏的猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus,PSV) TaqMan实时荧光定量(RT-qPCR)检测方法,为临床快速检测PSV提供新方法.[方法]参照GenBank中PSV的全基因序列,针对PSV 5'端保守区设计1对特异性引物,PCR扩增目的片段,将目的片段克隆至pMD-18T载体,构建阳性重组质粒,并以阳性质粒标准品为模板,建立标准曲线.在此基础上,设计特异性引物与探针,进行反应体系和反应条件优化,建立PSV TaqMan RT-qPCR检测方法,并对方法的敏感性、特异性和重复性进行验证.应用建立的方法对2018-2019年在河南不同地区猪场收集的83份样品(粪便样品39份,肠道样品44份)进行检测.[结果]建立了PSV TaqMan RT-qPCR检测方法,该方法的灵敏度为3.88×101拷贝/μL;与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应,特异性良好;批内与批间变异系数均小于1.0%,重复性较好.临床样品检测结果表明,TaqMan RT-qPCR检测PSV呈阳性的样品有31份(22份粪便样品,9份肠道样品)检出率为37.3%(31/83),显著高于普通PCR检测结果(检出率12.0%(10/83)).[结论]建立了TaqMan RT-qPCR检测方法,该方法灵敏度高,特异性好.
译  名:
Establishment of a TaqMan fluorescent real-time quantitative PCR for detection of porcine sapelovirus

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