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Position: Home > Articles > Development of a multiplex RT-PCR assay for differentiation of Japanese encephalitis virus genotypesⅠfrom Ⅲ Chinese Veterinary Science 2014 (4) 419-424

日本脑炎病毒基因Ⅰ型与Ⅲ型复合RT-PCR鉴别方法的建立

作  者：
张亮;刘澣扬;石双艳;袁磊;伍锐
单  位：
四川农业大学动物医学院猪病研究中心;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所;四川农业大学;四川农业大学预防兽医研究所猪病研究中心四川农业大学动物医学院人兽共患病研究室农业部兽用药物与兽医生物技术四川科学观测实验站;四川农业大学动物医学院人兽共患病研究室
关键词：
日本脑炎病毒;复合RT-PCR;基因Ⅰ型;基因Ⅲ型;鉴别
摘  要：
为建立一种简单快捷的鉴别日本脑炎病毒(JEV)基因Ⅰ型与基因Ⅲ型的方法,根据基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV的保守序列,分别设计合成了针对基因Ⅰ型和Ⅲ型JEV的RT-PCR引物P1、P3和P2、P3,以JEV SA14-14-2和CZ1株的核酸提取液为模板,通过对反应体系及条件的优化,建立了一种可快速鉴别JEV基因Ⅰ型与Ⅲ型的复合RT-PCR方法,并用建立的方法对27份临床样品进行了检测。结果显示,以设计合成的引物进行复合RT-PCR扩增,得到与基因Ⅰ型JEV预期相符的381bp的特异性条带,得到与基因Ⅲ型JEV预期相符的550bp的特异性条带,而对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒及猪伪狂犬病病毒核酸的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果显示,该方法对基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV的最小检出量分别为1.0pg/μL和10pg/μL。利用建立的复合RT-PCR方法对27份临床样品进行检测,结果5份为基因Ⅰ型,2份为Ⅲ型,与核苷酸序列分析结果一致。结果表明,建立的复合RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速简便等特点,可用于检测及鉴别基因Ⅰ型与基因Ⅲ型JEV。
译  名：
Development of a multiplex RT-PCR assay for differentiation of Japanese encephalitis virus genotypesⅠfrom Ⅲ
作  者：
ZHANG Liang;LIU Han-yang;SHI Shuang-yan;YUAN Lei;WU Rui;HUANG Xiao-bo;WEN Yi-ping;WEN Xin-tian;CAO San-jie;Swine Disease Research Center,Institute of Preventive Veterinary Medicine,Sichuan Agricultural University;Laboratory of Zoonosis,College of Veterinary Medicine,Sichuan Agricultural University;Sichuan Science-observation Experiment Station of Veterinary Drugs and Veterinary Biological Technology,Ministry of Agriculture;
关键词：
Japanese encephalitis virus(JEV);;multiplex RT-PCR;;genotypeⅠ;;genotypeⅢ;;differentiation
摘  要：
To develop a simple and rapid method for differentiation of Japanese encephalitis virus(JEV) genotypesⅠ(GⅠ)from Ⅲ(GⅢ),RT-PCR primers(P1and P3)specific to JEV-GⅠ and primers(P2and P3)specific to JEV-GⅢ were designed according to the sequences of JEV in GenBank,respectively.Nucleic acids of JEV SA14-14-2and JEV CZ1strains were extracted and used as template,and after optimization of the reaction conditions,a simple and rapid multiplex RT-PCR method was established.Twenty-seven clinical samples collected from pig herds were detected by the established multiplex RT-PCR assay.In result, the specific fragments 381bp and 550bp were amplified from GⅠand GⅢof JEV strains,respectively,but not from swine fever virus,porcine parvovirus,porcine reproductive and respiratory syndrome virus,porcine circovirus and pseudorabies virus.The sensitivity of the multiplex RT-PCR reached 1.0pg/μL and 10 pg/μL RNA for GⅠand GⅢof JEV strains,respectively.The multiplex RT-PCR results of the 27samples showed that five of these were GⅠ and two were GⅢ.The results showed that this multiplex RT-PCR assay was rapid,sensitive and specific to differentiating JEV GⅠstrains from GⅢstrains.

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