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CRISPR/Cpf1双切刻系统的构建与活性检测

作  者:
张权威;都萌萌;翟双双;赵金山;李和刚
单  位:
关键词:
CRISPR/Cpf1;双切刻系统;突变体;人工改造;crRNA
摘  要:
Cpf1是2类V型CRISPR-Cas系统的单个RNA引导的核酸内切酶,具有切割DNA的核酸酶活性.该系统由Cpf1核酸酶和CRISPR RNA(crRNA)组成,对于如何提高CRISPR/Cpf1系统的基因编辑效率主要集中在增强crRNA的稳定性、设计对PAM要求更简单的Cpf1变体或者鉴定新型Cpf1核酸内切酶.然而,其是否适用于构建双切刻系统还有待验证.因此,本研究旨在设计3种AsCpf1突变体以及成对的crRNA,进行瞬时转染,利用双荧光素酶报告基因检测评估AsCpf1双切刻系统的编辑效率;同时探究人工改造的crRNA能否提高AsCpf1双切刻系统的编辑效率;以及设计6对具有拓展PAMs序列的crRNA靶向位点,评估HkCpf1双切刻系统在哺乳动物基因组中的编辑效率.结果显示:3种AsCpf1突变体均能不同程度地提高报告基因的相对活性,并具有切割DNA单链的能力.在AsCpf1 crRNA发生突变和延伸后,它们仍然具有引导AsCpf1双切刻系统切割DNA单链的能力.HkCpf1不仅可以用做构建双切刻系统还具有较高的切割活性,并且可以识别5'-YTN和5'-TYYN PAMs序列,与AsCpf1相比,显著拓宽了其靶向范围.
译  名:
Construction and Activity Evaluation of CRISPR-Cpf1 Double-nicking System

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