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慢病毒载体介导稳定表达Cpf1的细胞系的构建及其基因编辑效率验证

作  者:
覃鸿妮;谢钰珍;陈罡;密苗苗;彭赛男;张勇
单  位:
苏州工业园区服务外包职业学院
关键词:
CRISPR/Cpf1;慢病毒载体;细胞系;基因编辑
摘  要:
[目的]通过慢病毒转染细胞构建稳定表达CRISPR/Cpf1的293 T和HT 1080细胞系,实现高效率基因编辑.[方法]PCR扩增AsCpf1和LbCpf1基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共转染293FT细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达LbCpf1和AsCpf1的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证.用设计好的针对ABCG1基因的sgRNA转染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率.[结果]成功构建了Cpf1-pLent慢病毒载体,重组载体对293 FT细胞进行慢病毒包装、浓缩与纯化后,病毒滴度均在10~6 TU/mL之上.用纯化后的病毒感染293 T和HT 1080细胞,筛选出3株能稳定表Cpf1的细胞系,目的ABCG1基因的基因编辑功能验证表明其中2株T7EΙ酶切掉带明显,sgRNA靶向敲除效率较高,命名为AsCpf1-293 T-7D和AsCpf1-HT1080 02-3B.[结论]建立了稳定表达Cpf1的293T和HT 1080细胞细胞系,可以用于目的基因的高效敲除.

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