摘 要：
我国利用远缘杂交方法在鱼类杂交优势利用上已经取得了不少成果[1 ] 。不仅如此 ,不少学者还通过胚胎发育形态学、染色体组型、同工酶等生化表型的研究对远缘杂交中的核质关系、基因表达、不亲和性原理进行了广泛探索[2— 5] 。本文在泥鳅 (ＭｉｓｇｕｒｎｕｓａｎｇｕｉｌｌｉｃａｕｄａｔｕｓＣａｎｔａ)与大鳞副泥鳅 (Ｐａｒａｍｉｓ ｇｕｒｎｕｓｄａｂｒｙａｎｕｓＳａｕｖａｇｅ)正反交子代染色体组型、胚胎发育形态变异以及部分同工酶谱分析等前期工作基础上 ,运用随机引物扩增多态ＤＮＡ(ＲａｎｄｏｍＡｍｐｌｉｆｉｅｄＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ ,ＲＡＰＤ)技术对其正反交子代及其相应亲本进行了遗传变异分析 ,从分子水平探索了两类鱼类杂交的遗传规律。1 材料与方法1 .1 实验鱼 泥鳅和大鳞副泥鳅亲本来自武汉市南湖 ,将亲本用绒毛膜促性腺激素肌肉注射进行人工催产 ,用量 :雌鱼 80 0ＩＵ/尾 ,雄鱼 40 0ＩＵ/尾 ,注射 8— 1 2ｈ后取精挤卵 ,干法受精。受精卵在水簇箱中培养至鱼苗阶段。1 .2 ＤＮＡ制备 将亲本断尾取全血 50 μＬ ,各组鱼苗各取 1 0尾混合 ,参照Ｔａｇｇａｒｔ等提出的方法制备总ＤＮＡｒ[6] 。1 .3 ＲＡＰＤ检测 随机引物 (1 0 -ｍｅｒ) 1 0 0种 ,购自上海Ｓａｎｇｏｎ生物工程公司。ＰＣＲ扩增仪为ＰＥ公司960 0型。Ｔａｇ酶购自华美生物工程公司。扩增反应体积 2 5μＬ。其中 :1 0×ｂｕｆｆｅｒ 2 5μＬ ,2 5ｍｍｏｌ/ＬＭｇ Ｃｌ 2 1 μＬ ,2ｍｍｏｌ/ＬｄＮＴＰ 1 5μＬ ,1 5ｎｇ/μ16 6μＬ。ＰＣＲ程序 :混合反应物 94℃变性 4ｍｉｎ ,循环 30次 (94℃ 1ｍｉｎ 36℃ 1ｍｉｎ 72℃ 2ｍｉｎ) ,最后72℃保温 1 0ｍｉｎ。扩增产物在 2 %琼脂糖凝胶中电泳。ＥＢ染色后拍照。实验分为两步 :首先参照Ｄａｗｉｓ等提出的混合ＤＮＡ扩增方法筛选引物[7] ,然后用筛选的引物分别对杂交子代及其相应亲本扩增。1 .4 数据处理 ＲＡＰＤ电泳结果产地转换成 0 .1数字矩阵 ,然后由ＲＡＰＤＰＬＯＴ转换成遗传距离 (ｄ =1 -ｓＳＡＢ =2ＳＡＢ/ＮＡ +ＮＢ) ,最后用ＰＨＹＬＩＰ软件包中Ｎｅｉｇｈｈｏｒ程序进行ＵＰＧＭＡ聚类分析。2 结果2 .1 引物筛选将亲本与各纽子代提取的ＤＮＡ等量混合后进行扩增 ,扩增带为 6条以上者为筛选的引物。从 1 0 0种引物中筛选的 30种引物的序列如下 (表 1 ) :表 1 筛选出的随机引物及其序列Ｔａｂ .1 Ｓｅｌｅｃｔｅｄｐｒｉｍｅｒｓａｎｄｔｈｅｉｒｓｅｑｕｅｎｃｅ序号Ｎｕｍｂｅｒ引物编号Ｐｒｉｍｅｒ ｎｕｍｂｅｒ引物序列Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ序号Ｎｕｍｂｅｒ引物编号Ｐｒｉｍｅｒ ｎｕｍｂｅｒ引物序列Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ1 Ｓ1Ｂ1ＧＴＴＴＣＧＣＴＣＣ 1 6Ｓ4 1Ｄ -1ＡＣＣＧＣＧＡＡＧＧ2Ｓ3 Ｂ3 ＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧ 1 7Ｓ4 5Ｄ -5ＴＧＡＧＣＧＧＡＣＡ3 Ｓ4 Ｂ4 ＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴ 1 8Ｓ4 8Ｄ -8ＧＴＧＴＧＣＣＣＣＡ4 Ｓ7 Ｂ7 ＧＧＡＴＧＣＧＣＡＧ 1 9Ｓ58Ｄ -1 8ＧＡＧＡＧＣＣＡＡＣ5Ｓ8Ｂ8ＧＧＧＴＧＣＧＣＡＧ 2 0 Ｓ60 Ｄ -2 0ＡＣＣＣＧＧＴＣＡＣ6Ｓ15Ｂ15ＧＴＣＣＡＣＡＣＧＧ 2 1 Ｓ71Ｃ -1 1ＡＡＡＧＣＴＧＣＧＧ7Ｓ19Ｂ19ＧＧＡＧＧＧＴＧＴＴ 2 2Ｓ76Ｃ -1 6ＣＡＣＡＣＴＣＣＡＧ8Ｓ2 1Ａ2 ＡＣＣＣＣＣＧＡＡＧ 2 3 Ｓ78Ｃ -1 8ＴＧＡＧＴＧＧＧＴＧ9Ｓ2 2 Ａ3 ＴＧＣＣＧＡＧＣＴＧ 2 4 Ｓ80 Ｃ -2 0ＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣ1 0 Ｓ2 7Ａ7 ＡＧＴＣＡＧＥＣＡＣ 2 5Ｓ86Ｇ -6ＧＴＧＣＣＴＡＡＣＣ1 1 Ｓ2 9Ａ9ＧＡＡＡＣＧＧＧＴＧ 2 6Ｓ88Ｇ -8ＴＣＡＣＧＴＣＣＡＣ1 2Ｓ34 Ａ14 ＴＣＴＧＧＣＴＧＧ 2 7Ｓ89Ｇ -9ＣＴＧＡＣＧＴＣＡＣ1 3 Ｓ35Ａ15ＴＴＣＣＧＡＡＣＣＣ 2 8Ｓ90 Ｇ -1 0ＡＧＧＧＣＣＧＴＣＴ1 4 Ｓ37Ａ17 ＧＡＣＣＧＣＴＴＧＴ 2 9Ｓ98Ｇ -1 8ＧＧＣＴＣＡＴＧＴＧ1 5Ｓ39Ａ19ＣＡＡＡＣＧＴＣＧＧ 30 Ｓ99Ｇ -1 9ＧＴＣＡＧＧＧＣＡＡ2 .2 泥鳅 (♀ )与大鳞副泥鳅 (♂ )杂交子代与相应亲本的扩增结果将记录的三尾泥鳅父本与一尾大鳞副泥鳅母本及其杂交子代的 30个随机引物扩增结果列于表 2。表 2 泥鳅 (♂ )×大鳞副泥鳅 (♀ )杂交子代与相应亲本的扩增结果Ｔａｂ .2 ＡｍｐｌｆｉｅｄｒｅｓｕｌｔｓｏｆｈｙｄｒｉｄｓｏｆＭａｎｇｕｉｌｌｉｃａｕｄａｔｕｓ(♂ )×Ｐ .ｄａｂｒｙａｎｕｓ(♀ )ａｎｄｔｈｅｉｒｐａｒｅｎｔｓ样本Ｓａｍｐｌｅ谱带总数ＴｏｔａｌｂａｎｄｎｕｍｂｅｒｓＭＦ1Ｐ共享带数ＢａｎｄｎｕｍｂｅｒｓｓｈａｒｅｄｂｙＭＦ1ＰＭＰ共享带数ＢａｎｄｎｕｍｂｅｒｓｓｈａｒｅｄｂｙＭＰＦ1Ｐ共享带数ＢａｎｄｎｕｍｂｅｒｓｓｈａｒｅｄｂｙＦ1ＰＦ1Ｐ共享带数ＢａｎｄｎｕｍｂｅｒｓｓｈａｒｅｄｂｙＦ1Ｐ相似系数 %Ｓｉｍｉｌａｒｉｅｔｙｉｎｄｅｓ %Ｍ(♂ ) 4 0 0 1 60 1 762 96-ＳＭＰ4 0 .3Ｆ14 32 1 60 -2 961 1 2 ＳＭＰ71 .2Ｐ(♀ ) 1 4 4 80 80 -1 1 2 ＳＭＰ66.7 注 :Ｆ1:杂交子代 Ｍ :泥鳅 Ｐ :大鳞泥鳅2 .3 大鳞副泥鳅 (♂ )与泥鳅 (♀ )及其杂交子代扩增结果2尾大鳞副泥鳅父本与 1尾泥鳅母本杂交子代及其相应亲本的 30个随机引物扩增结果统计列于表 3。表 3 大鳞副泥鳅 (♂ )×泥鳅 (♀ )杂交子代与相应亲本的扩增结果Ｔａｂ.3 ＡｍｐｌｆｉｅｄｒｅｓｕｌｔｓｏｆｈｙｄｒｉｄｓｏｆＰ(♂ )×Ｍ(♀ )ａｎｄｔｈｅｉｒｐａｒｅｎｔｓ样本Ｓａｍｐｌｅ谱带总数ＴｏｔａｌｂａｎｄｎｕｍｂｅｒｓＰＦ1Ｐ共享带数ＢａｎｄｎｕｍｂｅｒｓｓｈａｒｅｄｂｙＰＦ1ＰＭＰ共享带数ＢａｎｄｎｕｍｂｅｒｓｓｈａｒｅｄｂｙＭＰＭＦ1共享带数ＢａｎｄｎｕｍｂｅｒｓｓｈａｒｅｄｂｙＭＦ1Ｆ1Ｐ共享带数ＢａｎｄｎｕｍｂｅｒｓｓｈａｒｅｄｂｙＦ1Ｐ相似系数 %Ｓｉｍｉｌａｒｉｅｔｙｉｎｄｅｓ %Ｐ(♂ ) 2 641 4 81 2 8-2 4 8ＳＭＰ4 1 .4Ｆ13361 4 8-1 2 0 2 4 8ＳＰＦ164.4Ｍ(♀ ) 1 52 80 80 80 -ＳＭＦ177.5 注 :Ｆ1:杂交子代 Ｍ :泥鳅 Ｐ :大鳞泥鳅2 .4 ＵＰＧＭＡ分析用Ｒａｐｄｐｌｏｔ软件将ＲＡＰＤ产生的条带转换成遗传距离矩阵 (ｄ =1 -ｓ) ,以ｄ值用ｐｈｙｌｉｐ软件包中ＮＪ程序 (ＵＰＧＭＡ法 )计算正反交子代与亲本的聚类分支图 (图 1 ,图 2 )0 .60Ｐ .ｄａｂｒｙａｎｕｓ(♂ )Ｍ .ａｎｇｕｉｌｌｉｃａｕｄａｔｕｓ(♀ )Ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ0 .60Ｍ .ａｎｇｕｉｌｌｉｃａｕｄａｔｕｓ(♂)Ｐ .ｄａｂｒｙａｎｕｓ(♀ )Ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ图 1 大鳞副泥鳅泥鳅 (♂ )、泥鳅 (♀ )及其子代ＮＪ分支聚类图Ｆｉｇ.1 ＮＪｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｎＲＡＰＤｆｏｒＰ .ｄａｂｒｙａｎａｓ(♂ )、Ｍ .ａｕｇｕｌｌｉｃａｎｄａｔｕｓ(♀ )ａｎｄｔｈｅｉｒｏｆｆｓｐｒｉｎｇ图 2 泥鳅 (♂ )、大鳞副泥鳅 (♀ )及其子代ＮＪ分支聚类图Ｆｉｇ.2 ＮＪｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｎＲＡＰＤｆｏｒＰ .ｄａｂｒｙａｎａｓ(♀ )、Ｍ .ａｕｇｕｌｌｉｃａｎｄａｔｕｓ(♂ )ａｎｄｔｈｅｉｒｏｆｆｓｐｒｉｎｇ3 讨论泥鳅与大鳞副泥鳅属于鳅科鱼类中两个不同的属 ,染色体数分别为 2ｎ =1 0 0和 2ｎ =48。无论以泥鳅为母本 ,还是以大鳞副泥鳅为母体 ,杂交子代都可正常发育 ,且有较高成活率 ,这一现象反映两者杂交具有较高亲和性。关于鱼类远缘杂交的亲和性 ,王祖熊等曾提出染色体组型相似者亲和性较大 ,这可能是染色体组型相似 ,亲本间基因组以及母本细胞质与父本核基因组之间有较小的差异[4] 。桂建芳等随后提出远缘杂交的亲和性与亲本的基因组大小和胚胎发育速度的同步与否密切相关 ,母本基因组大 ,父本基因组小 ,两者胚胎发育速度相近者 ,杂交时具有较大亲和性[5] 。比较泥鳅和大鳞副泥鳅胚胎发育速度大部分是相近的[8,9] ,但泥鳅的基因组比较大。武汉地区的泥鳅为四倍体 ,它与鲤、鲫等鱼类一样是进化中由 2倍体经多倍化演化而成的 ,但我国南方泥鳅为二倍体 ,综合这一情况 ,可能预示武汉地区泥鳅虽然基因组大于大鳞副泥鳅 ,而实际组成却是接近的。赵振山曾在正反杂交子代的核型分析中看到子代的染色体数均为 74,且核型相似 ,这从一个侧面说明了它们的相似性。本实验在正反杂交实验中对亲本的遗传变异分析表明 ,大鳅副泥鳅与泥鳅的相似系数在 0 4以上。在群体遗传研究中 ,一级亲缘关系的相似系数在 0 5左右。因此本结果从分子水平说明了泥鳅和大鳞副泥鳅因亲缘关系较近 ,基因组成有较大相似性 ,因而在杂交中具有较高的亲和性。泥鳅和大鳞副泥鳅正反杂交子代的表型性状都偏向于母体 ,这与湘鲮、桂华鲮杂交子代 ,以及鲤、鲫、白鲫与鲢杂交中成活较高的大型杂交个体的趋势是一致的[4,5] 。性状是基因协同表达的综合效应。鱼类酶学研究表明杂种胚胎在父母本基因均表达的模式中 ,大多数是母本基因优先激活[1 0 ] ,赵振山在比较泥鳅与大鳞副泥鳅杂交子代胚胎发育的研究中也有类似现象[1 1 ] ,本实验中正反杂交子代与亲本的相似系数都在 0 6以上 ,而与母本的相似系数为 0 71和 0 75。这种子代与母本的相似系数大于父本 ,一方面说明在远缘杂交中子代的遗传信息并非均等来自双亲 ,另一方面也为杂交子代的表型近于母本提供了分子依据。泥鳅与大鳞副泥鳅正反交子代遗传变异的RAPD分析@龙良启$华中农业大学水产学院!武汉430070
@赵振山$华中农业大学水产学院!武汉430070
@汤保贵$华中农业大学水产学院!武汉430070
@潘黔生$华中农业大学水产学院!武汉430070
@熊邦喜$华中农业大学水产学院!武汉430070泥鳅;;大鳞副泥鳅;;正反交;;随机扩增多态DNA[1 ] 李元善 .雌核发育、多倍体和远缘杂交在鱼类育种中的应用 [J].淡水渔业 ,1 982 ,5:2 9
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