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在ALV-K gp85交叉干扰下ALV-A gp85突变位点的研究

作  者:
李锦群;梁灿新;郑小雪;陈建;郭妍妍;李文静;陈湘;曹伟胜
单  位:
华南农业大学兽医学院
关键词:
A亚群禽白血病病毒;gp85;慢病毒载体;交叉干扰;突变
摘  要:
禽白血病病毒(ALV)囊膜表面蛋白gp85与细胞受体的结合介导病毒侵入细胞。A亚群ALV(ALV-A)与K亚群ALV(ALV-K)共用细胞中的Tva受体,在ALV-K gp85交叉干扰下,ALV-A gp85与Tva结合的关键氨基酸位点可能发生突变以重新建立有效感染。为鉴定这些位点,本研究以前期构建的pCAGGS-s-K-gp85-flag为模板,经PCR扩增融合信号肽s和标签flag的ALV-K gp85基因并克隆至pLV-sfGFP(2A)Pure慢病毒载体,构建重组慢病毒质粒pLV-s-K-gp85-flag-GFP,并经酶切和测序鉴定后与辅助质粒共转染HEK293T细胞,包装获得重组慢病毒。将重组慢病毒感染DF-1细胞,通过嘌呤霉素筛选获得细胞系DF-1/K-gp85。RT-qPCR和western blot检测结果显示,DF-1/K-gp85能够稳定表达ALV-K gp85基因并将62 ku左右的ALV-K gp85蛋白分泌至细胞上清;荧光和ALV p27抗原ELISA检测结果显示,过表达ALV-K gp85蛋白能够有效抑制MOI 1 ALV-A重组病毒RCASBP(A)-Mcherry的感染。将RCASBP(A)-Mcherry接种DF-1/K-gp85并连续传20代,通过测序共检测到7个ALV-A gp85突变位点(第5代:S272N、P280L和F288S;第10代:L154P;第15代:T127A;第20代:L154P、R173G和R212H)。进一步表达野生型(wt)和L154P突变的ALV-A gp85重组蛋白,将其分别与DF-1细胞孵育,然后接种MOI 0.1 RCASBP(A)-Mcherry,进行交叉干扰试验,流式细胞术检测结果显示,L154P组Mcherry阳性细胞百分比显著高于ALV-A gp85wt组;另外构建L154P突变的重组病毒载体RCASBP(A)-EGFP L154P,将其与RCASBP(A)-EGFP分别转染DF-1细胞,5 d后经流式细胞术检测结果显示,RCASBP(A)-EGFP L154P组EGFP阳性细胞百分比显著低于RCASBP(A)-EGFP组;进一步将0.1 MOI RCASBP(A)-EGFP L154P和RCASBP(A)-EGFP重组病毒分别感染DF-1/K-gp85细胞系,7 d后采用ALV p27抗原ELISA检测结果显示,RCASBP(A)-EGFP L154P组S/P值显著高于RCASBP(A)-EGFP组,提示RCASBP(A)-EGFP L154P可能利用了其他受体侵入细胞。上述结果首次表明L154是ALV-A结合Tva受体及启动感染的关键位点。本研究为阐明ALV-A gp85与细胞受体相互作用的分子机制奠定了基础。

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